Caracterização estrutural e funcional do gene pacCl, que codifica o regulador transcricional de resposta ao pH, de Colletotrichum lindemuthianum, agente causal da antracnose do feijoeiro

Abstract

Desde o contato inicial até o estabelecimento dos sintomas da doença, C. lindemuthianum regula a expressão diferencial de genes essenciais para a patogenicidade que vão possibilitar a colonização do tecido hospedeiro e a finalização do seu ciclo de infecção. Nesse trabalho, o gene pacCl, que codifica o regulador transcricional de resposta ao pH ambiental, foi isolado e caracterizado estrutural e funcionalmente. Uma sequência de 2.546 pb foi isolada do banco genômico de C. lindemuthianum, correspondente ao gene pacCl. Esta sequência apresenta uma ORF de 1.746 pb, codificando, portanto, uma proteína de 581 resíduos de aminoácidos. Foram identificados na sequência, três íntrons putativos, contendo 60, 58 e 74 pb, cada um deles. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida da proteína, com as sequências disponíveis nos bancos de dados, demonstrou elevado grau de identidade e similaridade da proteína identificada com o regulador transcricional PacC/Him101 de fungos filamentosos e leveduras, respectivamente. Além disso, a proteína PacCl se mostrou eficiente como marcador filogenético em fungos, pois agrupou de forma coerente os organismos taxonomicamente relacionados. A hibridização de DNA usando o gene pacCl como sonda, mostrou que o gene encontra- se em uma única cópia no genoma de C. lindemuthianum. Do mesmo modo, a análise do mutante Mutpac2 por hibridização de DNA, confirmou que o gene pacCl havia sido inativado por um evento de recombinação homóloga do tipo troca gênica. Por fim, a técnica de PCR quantitativo em tempo real mostrou que o gene pacCl é expresso em todas as fases do ciclo de infecção, porém, os maiores níveis foram encontrados no final da fase necrotrófica. Pode-se sugerir que um dos fatores responsáveis por esse aumento, seja a alcalinização do tecido vegetal, decorrente do envelhecimento do tecido, e/ou até mesmo da própria atividade do fungo, que em muitos casos secreta substâncias alcalinizantes, como por exemplo, amônia.

From the initial contact to the establishment of the symptoms of the disease, C. lindemuthianum regulates the differential expression of the genes that are essential to the pathogenicity and will make possible the colonization of the host tissue and the conclusion of its infection cycle. In this study, the pacCl gene codifying the transcriptional regulator of the response to the environmental pH was isolated and structurally and functionally characterized. A 2.546 pb sequence was isolated from the genomic bank of C. lindemuthianum, corresponding to the gene pacCl. This sequence shows an ORF with 1.746 pb, therefore codifying a protein containing 581 residues of amino acids. In the sequence, three putative introns containing 60, 58 and 74 pb each one were identified. The multiple alignment of the protein-deduced sequence with the sequences available in the data file showed both high identity level and similarity of the protein identified with the PacC/Him101 transcriptional regulator of filamentous fungus and yeasts, respectively. In addition, the PacCl protein was shown to be efficient as a phylogenetic marker in fungus, since it coherently grouped those taxonomically related organisms. The DNA hybridization by using the pacCl gene as probe showed the gene is found in one single copy in the genome of C. lindemuthianum. In the same way, the mutant Mutpac2 analysis by hybridization of DNA corroborated the gene pacCl was inactivated by an event of the genic exchange-type homologous recombination. Finally, the quantitative PCR technique in real time showed the pacCl gene to be expressed in all phases of the infection cycle, but the highest levels were found at the end of the necrotrophic phase. It can be suggested that one of the factors responsible for this increase to be the alkalization of the vegetal tissue due to the aging of the tissue and/or even from the activity of the fungus, since in many cases it secretes some alkalinizing substances such as the ammonia.