Estudo in vitro do potencial antiviral de ácido trans- cinâmico, flavonóides, corante monascus e extratos vegetais sobre o Herpesvirus equino 1

Abstract

O Herpesvirus equino 1 (EHV-1), um importante patógeno de cavalos, foi escolhido como vírus alvo, pois representa uma família altamente patogênica e apesar de já haver vacinas contra ele, elas são pouco eficientes. Assim, um novo tratamento que evite perdas financeiras irreparáveis em criações de cavalos é bastante relevante. Por outro lado, os produtos naturais são alvos das mais diversas pesquisas para formulação de novos medicamentos, dentre eles os antivirais por possuírem um elevado potencial terapêutico. Neste trabalho, realizamos ensaios biológicos em cultivo celular com células Vero para determinar o efeito citotóxico e os potenciais antivirais de 8 compostos (quatro substâncias puras, um extrato de microrganismo e três extratos vegetais de uma mesma espécie). As citotoxicidades foram determinadas por microscopia óptica e confirmadas usando uma variação do método colorimétrico baseado na redução do sal MTT. Com o objetivo de investigar in vitro o potencial antiviral de cada tratamento sobre o EHV-1, foi feita a avaliação da redução de título viral por visualização do efeito citopático seguida de titulação viral em três ensaios antivirais, o de “Inativação Direta”, o “End Point” e o “Timing of Addition”. O primeiro teve como objetivo determinar se os tratamentos possuem ação sobre as partículas virais desestabilizando-as ou se ligando a elas de forma irreversível. O segundo tem como objetivo determinar se as substâncias puras ou presentes nos extratos se ligam aos receptores celulares ou a outras estruturas moleculares causando modificações celulares duradouras. O terceiro foi realizado com o objetivo de determinar a ação dos compostos sobre quatro etapas do ciclo infectivo viral, avaliando se apresentam ação antiviral em fases específicas da infecção. Os resultados dos testes demonstraram que as concentrações máximas não tóxicas obtidas foram respectivamente, 70, 100, 120, 110 e 70 μg/mL para a quercetina, morina, rutina, ácido trans-cinâmico e monascus; 40, 40 e 90 μg/mL para os extratos E1, E2, E3, respectivamente e 3,0% (v/v) para o DMSO. Nas concentrações testadas, o DMSO não causou variação significativa no título viral em nenhum dos testes, sendo, portanto, um composto inerte. A rutina não demonstrou ação antiviral significativa em nenhum dos testes. Os extratos apresentaram maior potencial antiviral contra o EHV-1 in vitro, seguidos das substâncias quercetina e morina. Nos resultados do teste de inativação direta, foi observada a ação dos três extratos, da quercetina e da morina. O E3 foi o único a apresentar ação no teste “End Point”. No “Timing of Addition”, todos os compostos apresentaram ação antiviral em pelo menos uma etapa de infecção, com exceção da rutina. A morina e o monascus sobre a adsorção, o ácido trans- cinâmico sobre os receptores celulares e na adsorção, a quercetina e o E2 nas fases de adsorção e penetração viral, e o E1 e o E3 em todas as fases. O processo de adsorção foi o mais afetado pelos compostos, sugerindo ação principalmente sobre as partículas virais e receptores celulares, impedindo momentos iniciais da infecção. Possivelmente, há nos extratos um efeito sinérgico decorrente da ação de mais de um composto. Com os resultados encontrados neste trabalho, concluímos que estes compostos poderão ser de grande importância nas medicinas veterinária e humana para prevenção e tratamento de infecções virais e para formulação de novos medicamentos.

The Equine herpesvírus 1 (EHV-1), a important pathogen of horses, was chosen as target virus because it represents a highly pathogenic family and although we already have vaccines against it, they are inefficient. Thus, a new treatment that avoid irreparable financial loses in creations of horses is quite relevant. On other hand, due to their high therapeutic potential, the natural products are targets of various researches for formulation of new medicines. In this work, we made biological assays in Vero’s cell culture to determine the cytotoxic effect and antiviral potential of 8 compounds (four pure substances, one microorganism extract and three plant extracts from the same specie). The cytotoxicidates were determined by optical microscopy and confirmed by using a variation of colorimetric method based on MTT salt reducing. In order to investigate in vitro the antiviral potential from each treatment on the EHV-1, we did the viral title reduction evaluation by viewing the cytopathic effect followed by viruses titration in three antiviral assays, "Direct Inactivation", "End Point" and "Timing of Addition". The first aimed to determine whether treatments have action on the viral particles, destabilizing them or binding to them on an irreversible way. The second aims to determine whether the pure substances or those who are in extracts bind to cell receptors or other molecular structures causing lasting cellular changes. The third was carried out to determine the action of the compounds on four stages of the viral infective cycle, assessing whether they have antiviral action in specific stages of infection. The assay results showed that the maximum non-toxic concentrations obtained were respectively, 70, 100, 120, 110 and 70 μg/mL to quercetin, morin, rutin, cinnamic acid and monascus; 40, 40 and 90 μg/mL to extracts E1, E2, E3, respectively and 3.0% (v/v) to DMSO. In the tested concentrations, the DMSO didn’t cause significant variation in viral title in any of the assays, being, therefore, an inert compound. The rutin has not shown significant antiviral action in any of the tests. The extracts had greater antiviral potential against EHV-1 in vitro, followed by quercetin and morin. In the direct inactivation assay results, it was observed the action of three extracts, of quercetin and of morin. The E3 was the single to submit action in the assay ‘’End Point ". In the "Timing of Addition," all compounds showed antiviral action in at least one infection stage, except for rutin. Morin and monascus on adsorption, cinnamic acid on cell receptors and adsorption, quercetin and E2 during the adsorption and viral penetration phases, and E1 and E3 at all stages. The adsorption process was the most affected by compounds, suggesting action mainly on the viral particles and cell receptors, preventing infection initial stages. Possibly, there is in extracts a synergic effect resulted from action of more than one compound. With the results found in this work, we find that these compounds may have great importance in human and veterinary medicines for prevention and treatment of viral infections and for formulation of new medicines.