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Tipo: Tese
Título: Enzimas lignocelulolíticas de fungos de podridão branca e fitopatógenos: produção, caracterização e aplicação em processos de sacarificação da biomassa
Ligninolytic enzymes from white-rot and phytopathogenic fungi: production, characterization and application in biomass saccharification process
Autor(es): Falkoski, Daniel Luciano
Abstract: Neste trabalho, seis diferentes cepas fúngicas isoladas de plantações de eucalipto foram avaliadas quanto aos seus potenciais para produção de enzimas lignocelulolíticas visando suas aplicações em processos biotecnológicos, mais precisamente, processos de sacarificação da biomassa. Os fungos Pycnoporus sanguineus, Trametes sp. J2, Trametes sp J5, isolado J-129 (um basidiomiceto não identificado), Chrysoporthe cubensis e Cylindrocladium pteridis foram cultivados em meio líquido (ML) e meio semi- sólido (MSS) contendo farelo de trigo, sabugo de milho, polpa Kraft e celulose microcristalina (Avicel) como fonte de carbono. Após 4, 8 e 12 dias de fermentação os extratos enzimáticos produzidos foram coletados e analisados para determinação das atividades de xilanase, endoglicanases, β-glicosidases, lacases e celulase total (FPase). Pycnoporus sanguineus apresentou as maiores atividades para FPase (polpa Kraft-MSS) e lacase (farelo de trigo-ML) sugerindo que este microrganismo pode ser utilizado como um eficiente produtor de ambos os grupos de enzimas: cellulases e ligninases. Chrysoporthe cubensis propiciou as maiores atividades para endoglicanase e β-glicosidase (farelo de trigo-SSF). Sendo assim, foi demonstrado pela primeira vez que C. cubensis possui um grande potencial para produção de enzimas (principalmente celulases) para aplicação em processos de sacarificação da biomassa. As maiores atividades xilanolíticas foram encontradas em extratos produzidos pelo fitopatógeno C. pteridis, o qual foi apto a secretar quantidades incomuns de xylanase (aproximadamente 150000 U L -1 ) quando cultivado em meio semi-sólido usando farelo de trigo como substrato. Pycnoporus sanguineus e C. cubensis secretaram as maiores atividades celulolíticas e por isto os extratos enzimáticos produzidos por estes microrganismos foram caracterizados e subseqüentemente aplicados em testes de sacarificação da biomassa. Além de celulases e xilanases, P. sanguineus e C. cubensis também mostraram uma marcante capacidade para secretar atividades de α-arabinofuranosidase, α-galactosidase, β-mananase e poligalacturonase. Além disto, baixas atividades para β-xilosidase e β-manosidase também foram detectados em ambos os extratos enzimáticos. As atividades celulolíticas (endoglicanase, FPase e β-glicosidase) e xilanolíticas produzidas por P. sanguineus e C. cubensis foram caracterizadas em relação a pH e temperatura ótimos e foi observado que todas as atividades enzimáticas analisadas foram maximamente ativas quando incubadas em uma faixa de pH entre 3,5 e 4,5. Os valores de temperaturas ótimas variaram entre 50 e 60 °C. Além disto, todas as atividades enzimáticas foram altamente estáveis nas temperaturas de 40 e 50 °C tendo mantido mais de 70 % de suas atividades residuais após 48 h de incubação. Os extratos celulolíticos de P. sanguineus e C. cubensis foram aplicados em experimentos de sacarificação utilizando bagaço de cana, previamente submetido à pré-tratamento ácido ou básico, como substrato e os resultados de sacarificação foram comparados com aqueles obtidos utilizando- se uma preparação comercial de celulases. O uso de pré-tratamento ácido foi pouco eficiente na remoção da lignina junto ao bagaço de cana e como conseqüência disso observou-se um baixo rendimento de sacarificação quando este substrato foi utilizado, independentemente do extrato enzimático aplicado. Por outro lado, quando bagaço pré-tratado com base foi utilizado como substrato, elevadas taxas de hidrólise foram observadas. Considerando-se a produção de equivalentes açúcares redutores, foram observados rendimentos de sacarificação de 89,0, 60,4 e 64,0 % após 72 h de reação nos ensaios conduzidos com extrato de C. cubensis, extrato de P. sanguineus e com a preparação de celulases comercial, respectivamente. A produção de glicose também foi avaliada e, similarmente, se observou uma maior liberação deste monossacarídeo nos ensaios realizados com extrato do fungo C. cubensis (52,7 %). Para os ensaios de sacarificação utilizando extrato de P. sanguineus e celulase comercial a produção de glicose observada correspondeu a 22,6 e 36,6 % do rendimento teórico possível, respectivamente. Os resultados obtidos sugerem que as seis cepas fúngicas avaliadas neste trabalho têm grande potencial como produtoras de enzimas para aplicações em processos biotecnológicos. Os extratos celulolíticos de P. sanguineus e C. cubensis demonstraram um grande potencial para serem utilizados em processos de sacarificação da biomassa uma vez que o desempenho de hidrólise observado para estes extratos foi similar ou superior àquele observado em ensaios utilizando-se uma preparação de celulases comercial.
In this work, six different fungi strain isolated from eucalyptus plantations were evaluated in relation to their ability to produce ligninolytic enzymes to biotechnological application, specifically, biomass saccharification for bioethanol production. The fungi Pycnoporus sanguineus, Trametes sp. J2, Trametes sp J5, isolated J-129 (a Basidiomycete unidentified), Chrysoporthe cubensis e Cylindrocladium pteridis were cultivated in submerged fermentation (SmF) or in solid state fermentation (SSF) using wheat bran, corn cobs, Kraft pulp or microcrystalline cellulose (Avicel) as carbon source. After 4, 8 and 12 days of fermentation, the enzymatic extract produced were analyzed in relation to xylanase, endoglucanase, β-glucosidase, laccase and total cellulase (FPase) activities. The white-rot Basidiomycete P. sanguineous presented the highest FPase (Kraft pulp-SSF) and laccase (wheat bran-SmF) activities, suggesting that this microorganism could be used as an efficient producer for the two groups: cellulases and ligninases. Chrysoporthe cubensis presented the highest endoglucanase and β-glucosidase (wheat bran-SSF) activities. Therefore, for the first time, it was demonstrated that C. cubensis has a great potential to enzyme production (mainly cellulases) that could be applied in biomass saccharification processes. The highest xylanolytic activities were detected in enzymatic extracts produced by the plant pathogenic C. pteridis, which was able to secrete uncommon amounts of xylanase activity (approximately 150000U L -1 ) when cultivated in SSF using wheat bran. P. sanguineus and C. cubensis were able to secrete the highest amounts of cellulolytic activities and therefore the enzymatic extracts produced by these microorganisms were characterized and subsequently applied in biomass saccharification experiments. Besides cellulases and xylanases, P. sanguineus and C. cubensis were also able to produce α-arabinofuranosidase, α-galactosidase, β-mananase and polygalacturonase. It was also detected low activities of β-xylosidase and β-mannosidase in both enzymatic extracts. The cellulolytic activities(endoglucanase, FPase and β-glucosidase) and xylanolytic activities produced by P. sanguineus and C. cubensis were characterized in relation to pH and temperature and it was observed that all activities were maximized in a pH range of 3.5-4.5. The optimum temperatures for those enzymes varied between 50 and 60 °C. Besides, all enzymatic activities were highly stable at 40 and 50 °C, maintaining more than 70 % of its residual activities after 48 h of pre incubation at the aforementioned temperatures. The enzymatic extracts from P. sanguineus and C. cubensis were employed in saccharification experiments using acid-treated or alkali-treated sugarcane bagasse as substrate. The saccharification results were compared to those obtained employing a commercial cellulase. The acid pretreatment presented low efficiency in lignin removal from sugarcane bagasse and as a consequence, it was observed a low yield of saccharification when acid-treated bagasse was hydrolyzed, independently from the cellulase extract utilized. On the other hand, when alkali-treated sugarcane bagasse was used as substrate for saccharification, high hydrolysis rates were observed. Considering equivalent reducing sugars production, it was observed saccharification yields of 89.0, 64.4 and 64.0 % after 72 h of hydrolysis reaction using extract from C. cubensis, extract from P. sanguineous and a commercial cellulase, respectively. The glucose production was also evaluated and, similarly it was observed a higher yield in the saccharification using extract from C. cubensis (52.7 %) than in those using extract from P. sanguineous (22.6 %) or commercial cellulase (36.6 %). The results obtained suggest that the six fungi strains evaluated in this work present a great potential to produce enzymes for application in biotechnological processes. The cellulolytic extracts from P. sanguineous and C. cubensis demonstrated a great potential to be employed in biomass saccharification processes, since their observed hydrolysis performances were similar or superior to that observed performance for commercial cellulase.
Palavras-chave: Enzimas de fungos
Biomassa vegetal
Hidrólise
Basidiomicetos
Fungos fitopatogênicos
Celulose
Hemicelulose
Biocombustíveis
CNPq: Bioquímica
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Citação: FALKOSKI, Daniel Luciano. Enzimas lignocelulolíticas de fungos de podridão branca e fitopatógenos: produção, caracterização e aplicação em processos de sacarificação da biomassa. 2011. 102 f. Tese (Doutorado em Bioquímica Agrícola) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. 2011.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/7674
Data do documento: 25-Fev-2011
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