Ação e propriedades cinéticas da peroxidase na oclusão xilemática de ave-do-paraíso (Strelitzia reginae Ait.)

Abstract

Com o intuito de melhor compreender os mecanismos pela qual a peroxidase (POD) está envolvida no bloqueio xilemático em hastes de ave-do-paraíso e como estes podem ser reduzidos ou inibidos, este trabalho teve como objetivos: purificar e caracterizar a POD; verificar o efeito da utilização de inibidores enzimáticos combinados ou não com pHs ácidos e a presença do corte periódico da base da haste sobre a vida pós-colheita dessas flores, avaliar o efeito da aplicação de substratos fenólicos na longevidade das flores e estudar as características inerentes à própria haste, que podem estar influenciando a longevidade das flores de ave-do-paraíso. Para a purificação da POD foi utilizada uma amostra composta de bases de várias hastes mantidas por 8 dias na água. Durante a extração, foi utilizado um processo de separação da POD solúvel da de parede, e o extrato bruto obtido foi purificado por meio da precipitação com sulfato de amônia e por cromatografia gélica. O extrato purificado foi utilizado para a caracterização enzimática. A atividade total no extrato bruto, a massa molecular estimada e o pH ótimo foram semelhantes para as duas isoenzimas. O processo de purificação só foi eficiente para a POD solúvel, e a POD de parede mostrou-se mais sensível aos aumentos de temperatura e apresentou maior afinidade com os substratos. Entre os inibidores enzimáticos testados, o mais eficiente foi o β-mercaptoetanol. No experimento de vaso, as hastes foram colhidas com um florete aberto e distribuídos entre os tratamentos que continham os inibidores metabissulfito de sódio ou azida sódica, combinados com pH 6,0 ou 2,5, aplicados na forma de pulsing por 24 h. Metade das hastes sofreram o corte da base, e a outra metade não. Para as hastes que não sofreram o corte da base, o melhor tratamento foi azida sózica, pH 6,0, que proporcionou maiores valores de massa fresca relativa e retardou o desenvolvimento do balanço hídrico negativo. Já o mesmo inibidor com o pH 2,5 causou toxidez, e por isso foi considerado o pior tratamento. O metabissulfito foi eficiente em retardar o escurecimento da base e reduziu a atividade da polifenoloxidase (PPO). Apesar destes resultados, a longevidade não apresentou diferenças estatísticas entre os tratamentos aplicados. Em outro experimento de vaso, substâncias fenólicas (catecol, 4-metilcatecol, pirogalol, pirocatequina e guaiacol, 10 mM) foram aplicadas como pulsing por 24 h e em experimento subsequente, o guaiacol foi aplicado como pulsing ou solução de vaso em concentrações de 5, 25 e 50 mM. A massa fresca relativa das hastes tratadas com essas substâncias fenólicas foram superiores as das hastes controles nos dois experimentos e o balanço hídrico negativo foi retardado. No entanto, essas hastes apresentaram escurecimento intenso da base, e a longevidade não foi prolongada. No último experimento, as hastes colhidas com um florete aberto foram separadas em 3 grupos de acordo com o diâmetro da base: I – finas (até 10 mm de diâmetro), II – médias (diâmetro maior que 10 e menor que 12 mm) e III – grossas (diâmetro maior que 12 mm). A presença do corte da base a cada 48 h também foi avaliado. Foram avaliadas as relações hídricas, o conteúdo de carboidratos, abertura de florete, tamanho de florete, longevidade, escurecimento da base e atividade da POD. A taxa da absorção de água só foi influenciada pela presença do corte da base, sendo maior para as hastes grossas que sofreram o corte da base, apresentando estas maiores valores de massa fresca relativa. Essas hastes também apresentaram maior abertura de floretes e longevidade. As taxas de transpiração não foram influenciadas pelo diâmetro da haste, nem pela presença do corte da base. O conteúdo de carboidrato variou com o diâmetro da haste, parte da planta avaliada (haste, bráctea ou florete), tempo e presença do corte. O escurecimento foi semelhante entre os 3 grupos e a atividade da POD foi maior nas hastes grossas. O tamanho da bráctea e da sépala aumentou proporcionalmente com o aumento no diâmetro da base. Conclui-se que a POD está mesmo envolvida no processo de obstrução xilemática em hastes de ave- do-paraíso, desempenhando um papel fundamental neste processo que culmina com o murchamento precoce dos floretes. No entanto, outros fatores, como diâmetro da haste e o conteúdo de reserva presente nessas podem estar influenciando a longevidade das flores.

In order to better understand the mechanisms by which the peroxidase (POD) is involved in xylem blockage in stems of bird of paradise and how these xylem blockage can be reduced or inhibited, this work aimed to purify and characterize POD; verify the effect of enzyme inhibitors combined or not with acid pH and the periodical cut of the base of the stem on the postharvest life of these flowers, evaluate the effect of phenolic substrates in the longevity of the flowers and study the characteristics inherent to the stem, which may be influencing the bird of paradise flowers longevity. To purify POD was used a sample of several bases maintained for 8 days in water. For the extraction, a procedure to separate the soluble POD from the cell wall POD was used, and the crude extract obtained was purified by precipitation with ammonium sulfate and by gel chromatography. The extract purified was used for enzymatic characterization. The total activity in the crude extract, the estimated molecular weight and pH optima were similar for both isoenzymes. The purification process was only effective for soluble POD. The cell wall POD was more sensitive to increases in temperature and had a higher affinity for the substrates. β- mercaptoethanol was the most efficient, among the enzyme inhibitors tested. In the vase experiment, stems were collected with an open floret and distributed among the treatments containing inhibitors sodium metabisulfite or sodium azide, combined with pH 6.0 or 2.5, applied as pulsing for 24 h. Half of the stems had undergone the cutting of the base, and the other half didn‟t. For stems that didn‟t have the cut in the base, the best treatment was sodium azide pH6.0, which led to higher values of relative fresh weight and slowed the development of negative water balance. However the same inhibitor at pH 2.5 caused toxicity, and therefore was considered the worst treatment. The metabisulfite was effective in delaying the darkening of the base and reduced polyphenoloxidase (PPO) activity. Despite these results, longevity showed no statistical differences among treatments. In a different vase experiment, phenolic substances (catechol, 4-methylcatechol, pyrogallol, pirocatequina and guaiacol 10 mM) were applied as pulsing for 24 h. and in a subsequent experiment, the guaiacol was applied as a vase solution or pulsing at concentrations of 5, 25 and 50 mM. The stems treated with these phenolic compounds showed higher relative fresh weight than those of control stems of the two experiments and the negative liquid balance was delayed. However, these stems had intense base darkening, and the longevity was not increased. In the last experiment, the stems collected with an open floret were separated into three groups according to the base diameter: I - thin (up to 10 mm diameter), II - medium (diameter greater than 10 and smaller than 12 mm) and III - thick (greater than 12 mm diameter). The base cutting at every 48 h was also evaluated. Were also evaluated the water relations, carbohydrate content, floret opening, floret size, longevity, darkening of the base and POD activity. The rate of water absorption was only changed by the presence of the base cutting, being greater for thick stems that have undergone the base cutting that also showed higher relative fresh weight. These stems also had a greater opening of florets and longevity. Transpiration rates were not influenced by the stem diameter or by the presence of the base cutting. The carbohydrate content changed with the stem diameter, the plant part evaluated (stem, bract or floret), cutting time and cutting presence. Darkening was similar among the three groups and POD activity was higher in thick stems. The size of the bract and sepal increases with the increase in base diameter. In conclusion, POD is really involved in xylem blockage of bird of paradise stems, playing a key role in this process that culminates in early wilting of the florets. However, other factors such as stem diameter and reserves content may be influencing the flowers longevity.