Caracterização da “via das lipoxigenases” em plantas de soja submetidas ao ataque de insetos-praga

Abstract

Lipoxigenases (EC: 1.13.11.12) são enzimas que catalisam a dioxigenação estereoespecífica de ácidos graxos polinsaturados que contêm o sistema cis,cis-1,4-pentadieno, formando hidroperóxidos que são posterior- mente metabolizados e produzem substâncias com atividades fisiológicas pronunciadas. As LOXs são responsáveis pela formação de compostos orgânicos responsáveis pelo “beany flavor” das sementes de soja, que reduz drasticamente a utilização desta oleaginosa na alimentação humana. Uma estratégia na eliminação deste sabor indesejável é a retirada, através de manipulação genética, das LOXs de semente. Além disso, é descrito o envolvimento dessas isoenzimas no crescimento e desenvolvimento, na senescência e na biossíntese de moléculas regulatórias. Este trabalho avaliou a capacidade da planta em responder ao ataque de insetos-praga (um mastigador e outro sugador) pela “via das lipoxigenases”, tendo sido realizadas análises bioquímicas e cinéticas do “pool” de lipoxigenases foliares e dos possíveis produtos finais da via. Foram utilizados dois genótipos de soja: um normal (variedade IAC-100) e outro com ausência completa de lipoxigenases nas sementes (linhagem IAC-100 TN). As plantas foram submetidas a uma população de insetos-praga (lagarta da soja ou mosca-branca) em gaiolas de filó. Para lagarta da soja, o primeiro trifolíolo da planta, no estádio V3 de desenvolvimento, foi coletado 6, 12 e 24 horas após o ataque da planta pelo inseto. A seguir o inseto foi retirado e o primeiro trifolíolo coletado após 6, 12, 24 e 48 horas. No caso da mosca-branca, o primeiro trifolíolo da planta, no estádio V3 de desenvolvimento, foi coletado 12, 24, 48 e 72 horas após o ataque da planta pelo inseto. Em seguida o inseto foi retirado e o primeiro trifolíolo coletado após 6, 12, 24 e 48 horas. Os resultados das análises bioquímico-cinéticas revelaram dois picos mais acentuados de atividade e atividade específica de lipoxigenases a pH 4,5 e 6,0 nos dois tratamentos, com temperatura ótima de atividade e atividade específica a 25 oC. Para ambos os genótipos, as atividades foram maiores nos tratamentos do que nos respectivos controles. Para a lagarta da soja, os valores de KM aparente, determinados no “pool” de lipoxigenases foliares de plantas de soja dos dois genótipos analisados, diminuíram a partir de 6 até 24 horas, em presença do inseto, e de 6 até 48 horas, após remoção do inseto. Para a mosca-branca, os valores de KM aparente no “pool” de lipoxigenases foliares de plantas de soja dos dois genótipos analisados decresceram com o tempo de ataque, ou seja, de 12 até 72 horas, em presença do inseto; após a remoção do inseto, estes valores voltaram a aumentar. A variação no valor de KM aparente para ambos os genótipos sugere uma alteração do “pool” de lipoxigenases em resposta ao ataque de insetos. Tanto no experimento com lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis Hübner) quanto naquele com mosca-branca (Bemisia argentifolii), observou-se aumento significativo na produção de inibidores de proteases após a remoção dos insetos, para ambos os genótipos analisados. Esses resultados, aliados aos dados obtidos para as constantes cinéticas, reforçam a hipótese de que as isoenzimas lipoxigenases são enzimas-chave no sistema de defesa de plantas de soja contra herbívoros e que o acúmulo de inibidores de proteases é, provavelmente, um mecanismo de defesa da planta. As análises dos níveis de hexanal e aldeídos totais nos dois experimentos revelaram aumento significativo nos níveis de aldeídos totais após a remoção dos insetos, para os dois genótipos, no tratamento com lagarta; e aumento mais significativo para mosca-branca antes da remoção, para a linhagem IAC- 100 TN. Uma produção significativa de hexanal só ocorreu para a variedade IAC-100, no tratamento com mosca-branca. Esses resultados sugerem que o mecanismo de defesa de plantas de soja submetidas ao ataque de insetos- praga, pela via das lipoxigenases, também pode seguir o caminho de produção de aldeídos.

Soybeans are the major oil and protein crop producer. Their grains have a high protein products, but they are less acceptable by the human consumer because of the “beany flavor” whick are caused by small compounds organic produced by lipoxygenase(EC: 1.13.11.12) acting upon polinsatured fatty acid. One strategy for eliminating the “beany flavor” is the removal of lipoxygenase isoenzymes (LOXs) from the seeds by genetic manipulation. However LOXs to be associated with the growth, development, senescence, temporary nitrogen storage, biosynthesis of regulatory molecules and protection against attack by insects and pathogens. This work evaluated the capacity of the plant to respond to the attack of the whitefly (sucking insect) and of the soybean caterpillar (Anticarsia gemmatalis Hübner) via the lipoxygenases pathway. The kinetic characterization of the “pool” of lipoxygenases and the final products of the pathway were determined. Two genotypes of soybean were used: one normal (cultivar IAC-100) and the other devoid of LOXs in the seeds (cultivar IAC-100 TN). The plants were placed in contact with the insects and the first trifoliate leaf was collected for the analysis. The results of the biochemical and kinetic studies showed two pronounced peaks of lipoxygenase activity at pH 4.5 and pH 6.0 with temperature optimum at 25 oC. The KMapp values decreased until 24 hours after removing the whitefly from the soybean and decreased until 48 hours after removing the soybean caterpillar, suggesting a change in the “pool” of LOX in response to the attack of the insects. Significant increase in the aldehydes after removing insects was observed. There was a noticeable increase in protease inhibitors for cultivar IAC-100 and IAC-100 TN after removing insects. This suggest that the production of protease inhibitors and aldehydes are involved in the defense mechanism of soybean plant against whitefly and soybean caterpillar injury. Genetic removal of LOX from the seeds has not changed the expression of LOX in the leaves which act on the defense mechanism of the soybean plant.