Isolamento de tetranortriterpenóides de sementes de Azadirachta indica (Nim) e avaliação da atividade nematicida sobre Heterodera glycines

Abstract

Os extratos brutos de nim foram preparados a partir de sementes extraídas seqüencialmente com hexano, metanol e água. O extrato metanólico foi particionado com acetato de etila e água seguido por tratamento com carvão ativo, repetindo-se 3 vezes e obtendo-se o extrato concentrado enriquecido com 60% de azadiractina A (Aza- A 60). Primeiramente, isolou-se azadiractina A através da injeção de 700 mg de Aza-A 60 no cromatógrafo em contracorrente (CCC), com coluna de politetrafluoretileno e 116mL de capacidade, utilizando-se o sistema bifásico hexano:butanol:metanol:água (1:0.9:1:0.9, v/v) eluído a 2mL/min, na direção cabeça-cauda. Coletaram-se 30 frações recuperando-se 95% do material injetado. Após monitoramento por cromatografia em camada delgada (CCD) usando-se tolueno:acetato de etila:metanol (10:1:2, v/v/v) como sistema eluente, as frações (9-13) foram purificadas por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (CLAE-FR) preparativa, utilizando-se uma coluna LC-8 (250 x 21 mm di, 5 μm) e metanol:água (50:50 v/v) a 6mL/min, sendo os efluentes monitorados num comprimento de onda de 217 nm. Assim, obteve-se Aza-A com 96% de pureza, segundo CLAE-FR analítica e sua estrutura foi confirmada por RMN 13 C. Num segundo estudo foram isolados azadiractina B (Aza-B), azadiractina H (Aza-H), desacetilnimbim (Dnim), desacetilsalanim (Dsal), nimbim (Nim) e salanim (Sal) injetando-se 4.2 g de Aza-A 60 (700 mg/corrida) no CCC seguindo as mesmas condições relatadas no isolamento de Aza-A. Após as 6 injeções, obtiveram-se duas frações principais que foram reunidas após monitoramento por (CCD), havendo recuperação de 97% do material injetado. A primeira delas, correspondendo à soma das frações (9-13) de cada injeção, foi purificada por CLAE-FR preparativa nas mesmas condições do isolamento de Aza-A, obtendo-se Aza-B e Aza-H, ambas com 97% de pureza, segundo análises por CLAE. A segunda fração, referente à soma das frações (17-30) de cada injeção, foi purificada utilizando-se metanol:água (60:40 v/v) a 8 mL/min, obtendo-se Dnim, Dsal, Nim e Sal, todos 97% puros após análises por CLAE analítica, sendo todas estruturas confirmadas por RMN 13 C. Todos os compostos purificados bem como extratos brutos de sementes de nim foram submetidos a ensaios de atividade nematicida sobre Heterodera glycines. Avaliando-se a mobilidade de juvenis do segundo estádio (J2), seguindo a metodologia do tubo invertido, verificou-se que ocorreu menor recuperação (P 0,05) dos J2 tratados com os extratos brutos aquoso (1/2 e 1/10 v/v) e metanólico (1000 ppm), sendo que o extrato hexânico não apresentou efeito nematicida. A atividade dos extratos brutos aquoso e metanólico foi atribuída, respectivamente, à presença de saponinas e triterpenóides (limonóides). Nos ensaios em casa de vegetação, plantas de soja inoculadas com juvenis tratados com os extratos aquoso (1/2 e 1/10 v/v) ou metanólico (1000 ppm) produziram menos fêmeas e ovos (P 0,05), se comparada à testemunha. O extrato de Aza-A 60 (70 ppm) causou maior imobilidade (P 0,05) dos J2 (92%), sendo esta proporcional às concentrações estudadas. A mortalidade dos J2 foi avaliada para todos os triterpenóides isolados nas concentrações de 0,8, 8 e 80 ppm, havendo redução do número de J2 recuperados com aumento das dosagens aplicadas. Nim e Sal a 80 ppm foram os mais efetivos causando 99% de mortalidade. Plantas de soja inoculadas com J2 tratados com os triterpenóides a 80 ppm apresentaram um efeito nematicida médio de 95% na redução do número de fêmeas e ovos (P 0,05), se comparados à testemunha. Com relação à eclosão dos ovos, os triterpenóides testados a 100 ppm apresentaram uma atividade ovicida média (P 0,05) de 50 %, em relação à testemunha, e não se observou ação nematostática até 96 horas após o tratamento.

Crude extracts were prepared from Neem seeds by sequential extraction with n- hexane, methanol and water. The methanolic extract was partitioned three times between ethyl acetate and water and treated with activated charcoal to obtain a concentrate (Aza-A 60) containing 60% azadirachtin A (aza-A). In the first study, aza- A (the major triterpenoid) was isolated by countercurrent chromatography (CCC) fitted with polytetrafluorethylene coil (116 mL volume) using the biphasic solvent system n- hexane:butanol:methanol:water (l:0.9:l:0.9,v/v) by injecting 700 mg of Aza-A 60 and eluting with 2mL/min, in the head to tail direction. Thirty fractions (3 mL each) were collected with 95% of the material being recovered. After monitoring by thin-layer chromatography (TLC) using toluene:ethyl acetate:methanol (10:1:2, v/v) as the developing solvent, the fractions (9-13) were purified by preparative reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) using the LC-8 stainless-steel column (5 μm, 250 x 21 mm id, Supelco) and methanol:water (50:50 v/v) as eluent at a flow rate of 6mL/min. The effluents were monitored at 217 nm. Aza-A thus obtained was about 96% pure according to HPLC analysis. The structure of aza-A was confirmed by NMR (13C). In the second study, six minor triterpenoids, i.e., azadirachtin B (aza-B), azadirachtin H (aza-H), desacetylnimbin (Dnim), desacetylsalannin (Dsal), nimbin (Nim) and salannin (Sal) were isolated by injecting 4.2 g of Aza-A 60 (700 mg/run) in CCC, using the same conditions as described for the isolation of aza-A. After the six injections, two main fractions were obtained and monitored by TLC with 97% of the injected material being recovered. The first fractions (9-13) were purified by RP-HPLC as described above to obtain aza-B and aza-H, both 97% pure as attested by analytical HPLC. The second fraction (17-30) was purified using methanol:water (60:40 v/v) at a flow rate of 8 mL/min, with dnim, dsal, nim and sal being obtained (each 97% pure) according to HPLC analysis and their structures being confirmed by NMR (13C). The nematicidal activity against Heterodera glycines of all the above-purified compounds and crude extracts was evaluated. The mobility of the second stage juveniles (J2) was evaluated by the inverted tube methodology. A smaller recovery (P 0.05) of J2 treated with the aqueous crude (l/2 and 1/10 v/v) and methanolic (1000 ppm) extract was obtained while the hexane extract did not present activity. The activity of the aqueous crude and methanolic extracts was likely due to the presence of saponins and triterpenoids (limonoids), respectively. In the greenhouse assay, soy plants inoculated with juveniles treated with the aqueous (l/2 and 1/10 v/v) or methanolic (1000 ppm) extract produced less females and eggs (P 0,05) as compared to the control. The extract Aza-A 60 (70 ppm) caused larger immobility (P 0,05) of J2 (92%), proportional to the studied concentrations. The mortality of J2 for all the isolated triterpenoids at concentrations of 0.8, 8 and 80 ppm was evaluated with a reduction in the number of the J2 recovered, observed with increase of the applied dosages. Nim and Sal at 80 ppm were the most effective causing 99% mortality. Soy plants inoculated with J2 treated with the triterpenoids at 80 ppm presented medium nematicidal effect of 95%, reducing the number of females and eggs (P 0,05) as compared to the control. In regard to egg hatching, the triterpenoids tested at 100 ppm showed medium ovicide activity (P 0,05) of 50% as compared to the control with no nematostatic activity being observed 96 h after treatment.