Caracterização das reservas de carbono e metabolismo de lipídeos em Pisolithus

Abstract

A mobilização de reservas de carbono é passo metabólico importante para a basidiosporogênese, a germinação de esporos e o estabelecimento das associações ectomicorrízicas. O objetivo deste trabalho foi o de estudar a composição das reservas de carbono durante as etapas de desenvolvimento do basidiocarpo de Pisolithus sp. e de investigar as vias de mobilização destes compostos no micélio, nas micorrizas e nos corpos de frutificação. As análises histoquímicas realizadas revelaram a presença de glicogênio no interior dos basídios e ao longo do desenvolvimento dos esporos. O RNA e as proteínas totais foram detectados nos basídios jovens, enquanto nos esporos maduros detectou-se apenas o RNA. Demonstrou-se a presença e a importância de diferentes biomoléculas no basidiocarpo, confirmando que os lipídeos são o tipo de reserva mais abundante. A análise dos ácidos graxos nas fases de desenvolvimento do basidiocarpo revelou que a composição em lipídeos não varia com a morfologia ou origem geográfica dos corpos de frutificação, sendo o 18:2w6,9 o mais abundante no início do desenvolvimento e o 18:1w9 o predominante nos esporos maduros. A análise de bancos de ESTs, construídos a partir de ectomicorrizas maduras de Pisolithus, permitiu a identificação de genes que codificam as enzimas de diferentes etapas do metabolismo lipídico, além dos que codificam enzimas da glicólise e da gliconeogênese. Os genes que codificam isocitrato liase e malato sintase foram identificados por meio de primers de seqüência degenerada, sendo as seqüências completas obtidas por meio da técnica de Genome Walking. Os genes da isocitrato liase, em ORF de 1897 pb, e o da malato sintase, de 1880 pb, apresentam ambos 5 íntrons e proteínas de 540 aa. A localização deduzida da isocitrato liase é peroxissomal, enquanto a da malato sintase não pôde ser inferida com base na seqüência protéica. Os padrões de expressão gênica para as micorrizas funcionais estabelecidas entre Pisolithus e Eucalyptus globulus e Populus trichocarpa são similares, como revelado pela análise de expressão dos genes do metabolismo lipídico, do ciclo do glioxilato e da gliconeogênese, em PCR em Tempo Real. A exceção foi a regulação positiva dos genes de enzimas de síntese e modificação de ácidos graxos na micorriza P. microcarpus-E. globulus. Os padrões de expressão gênica de peridíolos indiferenciados e jovens foram similares, sendo as principais alterações observadas nos peridíolos maduros e esporos internos. A regulação positiva dos genes relacionados à β-oxidação e ao ciclo do glioxilato nos peridíolos maduros evidencia a utilização de lipídeos durante a formação dos esporos. Da mesma forma, o aumento das taxas de expressão dos genes relacionados à síntese de ácidos graxos nos esporos internos sugere que a síntese das reservas lipídicas ocorre no interior desses propágulos. Os genes que codificam enzimas do ciclo do glioxilato e gliconeogênese no micélio vegetativo são regulados positivamente na presença de acetato e reprimidos por glicose. No entanto, o micélio não foi capaz de metabolizar o [2-13C] acetato de sódio extracelular, acumulando-o nas hifas fúngicas. Após 72 horas de carência de glicose, ocorreu a indução da expressão das enzimas da β-oxidação, do ciclo do glioxilato e da gliconeogênese. Nestas condições, demonstrou-se a ocorrência do consumo das reservas lipídicas nas hifas por meio da coloração com Vermelho do Nilo. A importância do controle transcricional no metabolismo de ácidos graxos de Pisolithus foi demonstrada pela análise conjunta dos dados de expressão gênica com as observações de microscopia e cromatografia gasosa. Os resultados obtidos neste trabalho representam importante avanço na compreensão do metabolismo lipídico em Pisolithus sp.

The mobilization of carbon storage compounds is an important metabolic step in processes such as basidiosporogenesis, spore germination, and establishment of the ectomycorrhizal association in Pisolithus. The objective of this work was to study the composition of the carbon reserve compounds during the development of Pisolithus basidiocarp as well as to investigate the mobilization pathways of these compounds in the mycelium, mycorrhizas, and fruit bodies. Histochemical analysis of the basidiocarps showed the presence of glycogen inside basidia and during spore development. Total RNA and proteins were detected in young basidia, although only RNA was found in the spores. The presence and relevance of different biomolecules in Pisolithus basidiocarp was demonstrated, confirming that lipids are the most important storage compound in this strutucture. Fatty acid analyses during different developmental stages of the basidiocarps showed that lipid composition is not influenced by morphology or geographic origin of the basidiocarp. The fatty acid 18:2w6,9 is the most abundant in the beginning of development, while 18:1w9 is the most important in matures spores. Analysis of EST databases from funcional ectomycorrhizas of Pisolithus led to the identification of genes coding for lipid metabolism enzymes as well as glycolysis and glyconeogenesis. The genes coding the glyoxylate cycle enzymes, isocitrato lyase and malate synthase, were identified using degenerated primers and the full length sequences were obtained by Genome Walking. Genes coding both isocitrate lyase and malate synthase, are interrupted by 5 introns, in ORFs presenting 1897 e 1880 bp respectively, and proteins of 540 aa. Also, the localization of isocitrato lyase is peroxissomal. Malate synthase localization cannot be predicted based on the amino acid sequence obtained. The expression analysis of lipid metabolism, glyoxylate cycle, and gluconeogenesis genes was done by Real Time RT-PCR. The patterns of gene expression in functional mycorrhizas of Pisolithus with Eucalyptus globulus or Populus trichocarpa were similar. The exception was the up regulation of the genes coding enzymes with a role in the synthesis and modification of fatty acids in P. microcarpus-E. globulus ectomycorrhiza. In Pisolithus basidiocarp gene expression patterns were similar in undifferentiated and young peridioles, and the most important changes were observed in mature peridioles and enclosed spores. The up-regulation of β-oxidation and glyoxylate cycle genes in mature peridioles indicates that lipids are used in the synthesis of precursor compounds during spore formation. Also, the up-regulation of the genes coding enzymes participating in the synthesis and modification of fatty acids in enclosed spores indicates that synthesis of storage lipids takes places inside these propagules. The expression of genes coding for glyoxylate cycle and gluconeogenesis in the vegetative mycelium were up-regulated in the presence of acetate and repressed by glucose. However, mycelium was not capable of using [2-13C] sodium acetate in its metabolism, accumulating this compound in the hyphae. After 144 hours of glucose starvation, the vegetative mycelium induced genes coding for β-oxidation, glyoxylate cycle, and gluconeogenesis enzymes. Under these conditions, the consumption of lipid reserves was observed in the hyphae stained with red Nile. The importance of transcriptional regulation of fatty acids metabolism is demonstrated by the analysis of gene expression, microscopy, and gas-chromatography. The results obtained in this work represent an important advance in the comprehension of lipid metabolism in the ectomycorrhizal fungus Pisolithus sp.