Atividade proteolítica de Pseudomonas fluorescens em biofilmes e detecção das células por anti-soro policlonal

Abstract

Os objetivos deste trabalho foram investigar a formação de biofilmes por estirpes de Pseudomonas fluorescens isoladas de leite cru refrigerado e a atividade proteolítica nesses biofilmes. Pesquisou-se, também, a viabilidade de detecção dessas células no leite, por métodos imunológicos. O potencial de desenvolvimento de biofilmes em superfície de aço inoxidável AISI 304 acabamento # 4 foi avaliado em temperaturas de 7 oC e 22 oC. O número de células de uma cultura mista constituída de sete estirpes de P. fluorescens, aderidas a placas de aço inoxidável aumentou, proporcionalmente ao aumento da população de células planctônicas, atingindo em torno de 108 UFC-CFU.mL-1, após 72 h de incubação em leite desnatado reconstituído (LDR) a 12%, a 22 oC. A maior atividade proteolítica constatada no sobrenadante de LDR 12% em presença de placas de aço inoxidável com células aderidas que, em ausência, sugere que células aderidas, ou, em biofilmes, podem secretar enzimas para o meio externo. A avaliação da adesão de células de culturas puras de P. fluorescens 041 e 097, em meio triptona extrato de levedura e fosfato (TYEP) e em LDR 1% ou 12%, indicou que o meio TYEP estimulou crescimento, mas, não a atividade proteolítica a 7 ºC e 22 ºC. Constatou-se que a capacidade de adesão com desenvolvimento de biofilmes é diferente entre as estirpes de uma mesma espécie. Adesão, formação de biofilmes e a atividade proteolítica são propriedades independentes, nas bactérias avaliadas. P. fluorescens 041 apresentou baixa capacidade de adesão a placas de aço inoxidável a 7 oC e uma alta atividade proteolítica, enquanto o número de células aderidas de P. fluorescens 097 foi da ordem de 109 UFC.mL-1 a 7 oC e 22 oC, mas apresentou atividade proteolítica menor. A observação dos biofilmes em microscópio eletrônico de varredura evidenciou que P. fluorescens 097 formou aglomerados com multicamadas celulares na superfície das placas de aço inoxidável. Anti-soros policlonais produzidos em nove coelhos contra misturas de estirpes de P. fluorescens apresentaram sensibilidades diferentes, com capacidade de detecção de células em concentrações que variaram de 103 UFC-CFU.mL-1 a 108 UFC.mL-1. Os anti-soros produzidos não apresentaram reação cruzada com outras espécies bacterianas contaminantes do leite cru refrigerado, à exceção dos anti-soros 2A e 3A que reagiram com Aeromonas. Aplicando-se técnicas de aglutinação em gota e de imunodot-blot, foram detectadas células de P. fluorescens em LDR 12% em concentrações de 103 UFCCFU. mL-1 e 105 UFC-CFU.mL-1. Estes resultados indicam o potencial desses procedimentos, para detectar células das bactérias deterioradoras, em uma faixa de concentração não-comprometedora da qualidade do leite.

The purposes of this work were to investigate the formation of biofilms from Pseudomonas fluorescens strains isolated from cold raw milk and proteolytic activity in these biofilms. Viability to detect these cells in milk was also investigated through immunological methods. Potential development of biofilms in AISI 304 stainless steel surface, finishing #4 was evaluated under temperatures of 7 ºC and 22 °C. The number of cells from a mixed culture composed of seven P. fluorescens strains adhered to stainless steel plates increased proportionally to the increase of planktonic cell population reaching about 108 UFC.mL-1 after 72 hours of incubation in 12% reconstituted skimmed milk (RSM) at 22 °C. Proteolytic activity verified in RSM supernatant 12% in the presence of stainless steel with adhered cells was higher than in the absence, which suggests that adhered cells, or in biofilms may secrete enzymes to the external medium. The evaluation of cell growth from pure P. fluoresnces cultures 041 and 097 in tryptone, yeast extract, phosphate (TYEP) medium and in RSM 1%, or 12% has indicated that TYEP medium stimulated growth, but not proteolytic activity at 7 ºC and 22 °C. It was verified that adhesion capacity with the development of biofilms is different among strains from the same species. Adhesion capacity with the development of biofilms and proteolytic activity are independent properties in the bacteria tested. P. fluorescens 041 presented low adhesion capacity to stainless steel plates at 7°C and high proteolytic activity whereas the number of P. fluorescens 097 adhered cells was about109 UFC.mL-1 at 7 ºC and 22°C. Proteolytic activity, however, was lower. Biofilm investigation witth scanning electron microscope made clear that P. fluorescens 097 has formed multilayered cell agglomerates on the surface of stainless steel plates. Polyclonal antisera produced in nine rabbits against mixtures of P. fluorescens strains presented different sensivtivity levels, with the capacity to detect cells in concentrations which vary from 103 UFC.mL-1 to 108 UFC.mL-1. Produced antisera have not presented cross-reaction with other contaminating bacterial species from cold raw milk, with the exception of 2A and 3A antisera which reacted with Aeromonas. P. fluorescens cells were detected at RSM 12% in 103 UFC mL-1 and 105 UFC.mL-1 concentrations when drop agglutination and imunodotblot techniques were applied. These results indicate the potential of these procedures to detect these damaging bacteria at a concentration level which does not affect the quality of the milk.