Purificação parcial e caracterização cinética da inibição de proteases intestinais tripsina-like de Anticarsia gemmatalis

Abstract

A Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), conhecida como lagarta da soja, é considerada a principal praga desta cultura, causando enormes prejuízos devido ao ataque herbívoro. Por causa da importância das proteases digestivas na fisiologia das larvas, o estudo de inibidores de proteases como agentes de controle de pragas tem recebido atenção contínua. A redução da atividade proteolítica através da ingestão de inibidores de proteases compromete a digestão e reflete em efeitos não apenas no crescimento e no desenvolvimento das larvas, mas também na fertilidade e fecundidade do adulto. Para utilizar a estratégia de controle via inibição das enzimas digestivas é necessário o esclarecimento sob o ponto de vista estrutura/função dessas macromoléculas. Uma forma de abordar esse aspecto implica no conhecimento sobre a cinética enzimática, assim como a caracterização da cinética de inibição destas proteases, o que permite uma melhor compreensão dos centros ativos e dos mecanismos de ação da enzima. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo estudar a cinética de inibição das serino-proteases intestinais de A. gemmatalis utilizando diferentes inibidores de proteases sintéticos e protéicos para identificar um potente inibidor a ser utilizado no processo de defesa de plantas de soja a A. gemmatalis. Para isso, um extrato solúvel do intestino de larvas de A. gemmatalis foi submetido à cromatografia em coluna de afinidade p-aminobenzamidina agarose e a fração eluída foi submetida à eletroforese. Foram observadas a presença de duas bandas com massas moleculares aproximadas de 35kDa e 66kDa. Na caracterização cinética o valor de KM para o substrato L-BApNA foi de 0,503mM, Vmáx foi 46,650nM.s-1, Vmáx/[E] foi 9,256nM.s-1.mg-1.L e Vmáx/[E]/KM foi de 18,402nM. s-1.mg-1.L. mM-1. No estudo de inibição os inibidores benzamidina, berenil, SKTI e SBBI obtiveram Ki de 11,2μM, 32,4μM, 0,25nM e 1,4nM, respectivamente, todos calculados pelo método de Dixon. Para caracterizar o tipo de inibição foi utilizado o gráfico do duplo recíproco de Lineweaver-Burk e o gráfico das inclinações de Lineweaver-Burk versus a concentração do inibidor. Para os quatro inibidores testados a inibição foi caracterizada como competitiva linear na faixa de concentração utilizada. Os valores de Ki determinados mostraram que o inibidor SKTI foi o que melhor inibiu a atividade tripsina-like das serino-proteases purificadas do intestino médio de A. gemmatalis tornando-se um alvo promissor de estudo para a produção de inibidores peptídeo miméticos.

Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera), the velvetbean caterpillar, is considered the main pest of soybean culture, causing important yield losses due to herbivorous attack. As the digestive proteases play fundamental roles in the larvae physiology, the study of protease inhibitors as agents for pest control is receiving continuous attention. The decrease in proteolytic activity due to the ingestion of proteases inhibitors impairs the digestion with consequences not only to the larvae growth and development but also to the adult fertility and fecundity. To use the control strategy via digestive enzymes it’s necessary to study the structure/function of these macromolecules. Enzyme kinetics, as well as the characterization of the kinetics of inhibition of these proteases would offer a better comprehension of active centers and the mechanisms of action of these enzymes. In this context, this work aimed to study the kinetics of inhibition of A. gemmatalis gut serine proteases using different synthetic and protein inhibitors and to identify a potent inhibitor to be used in the defense process of the soybean plants against A. gemmatalis. For this purpose, soluble extract from the gut of A. gemmatalis larvae was submitted to affinity chromatography in p-aminobenzamidine agarose and the eluted fraction was submitted to electrophoresis. The presence of two bands with approximate molecular mass of 35kDa and 66kDa was observed. In the kinetics characterization the KM value for the substrate L-BApNA was of 0,503mM, Vmax was 46,650nM.s-1, Vmax/[E] was 9,256nM.s-1.mg-1.L and Vmax/[E]/KM was 18,402nM. s-1.mg-1.L. mM-1. In the inhibition study the inhibitors benzamidine, berenil, SKTI and SBBI obtained Ki of 11,2μM, 32,4μM, 0,25nM and 1,4nM, respectively, all calculated using Dixon’s method. It was used to characterize the inhibition type the double reciprocal plot of Lineweaver-Burk and the graph of the slopes of Lineweaver-Burk versus the inhibitor concentration. For the four tested inhibitors the inhibition was characterized as linear competitive in the concentration range used. The determined values of Ki showed that SKTI was the best inhibitor of the activity of trypsin-like of purified serine-proteases from medium gut of A. gemmatalis becoming a promising target of study for the production of mimetic peptide inhibitors.