Identificação de fatores de transcrição que controlam a expressão do gene GmASR3 de soja

Abstract

Proteínas ASR (ABA, Stress and ripening induced protein) são induzidas em situações de estresses, maturação ou na presença de ABA, em diversas espécies vegetais, como Lírio (Lilium longiflorum); cana de açúcar (Saccharum officinarum); uva (Vitis vinífera); arroz (Oriza sativa); petúnia, banana (Musa acuminata e Musa balbisiana) e milho (Zea mays), entre outros. No entanto nenhum gene ASR foi encontrado em Arabidopsis. ASRs são proteínas pequenas, hidrofílicas e sem estrutura definida. Sua função é desconhecida, assim como a via de sinalização a qual pertencem. Em soja foi relatada a presença de três ASRs, que foram denominadas GmASR1, GmASR2 e GmASR3. Este trabalho buscou identificar proteínas que interagem com a região promotora de GmASR3, assim como fatores que se ligam à proteína GmASR3. Após analise em bancos de dados, a região promotora em torno de 500pb a montante do códon de iniciação da transcrição foi obtida a partir de PCR realizado com o DNA genômico de soja (Glycine max, cultivar CD206) e clonado em plasmídeo pHIS2.1. Esta construção foi transformada em leveduras S. cerevisiae W303 para posterior triagem líquida de cDNAs que expressam fatores capazes de interagir com o promotor de GmASR3, a partir do método do mono-híbrido de leveduras. Foi verificado que a proteína GmASR3 possui fraca capacidade de transativação nas condições utilizadas, o que possibilitou a realização de experimentos de duplo-híbrido com o fim de identificar fatores que se ligam à proteína GmASR3. Os fatores que se ligam a GmASR3 foram obtidos através do método do duplo-híbrido de leveduras, utilizando para isso leveduras S. cerevisiae AH109 portadoras do plasmídeo pDest32 ao qual foi inserido a sequencia do cDNA de GmASR3. As triagens de mono e duplo-híbrido foram realizadas utilizando o método da triagem líquida em placas deep well. As colônias que foram consideradas portadoras dos fatores que interagem com o promotor ou com a proteína GmASR foram retransformados em E. coli Dh5α e enviados para sequenciamento.

ASR Proteins are ABA, stress and ripening induced proteins present in various plant species such as lily (Lilium longiflorum), sugarcane (Saccharum officinarum), grape (Vitis vinifera) ; Rice (Oryza sativa), petunia, banana (Musa acuminata and Musa balbisiana) and corn (Zea mays). However no single ASR gene has been found in Arabidopsis. ASRs are small, hydrophilic and unstructured proteins. Its function, as well as the signaling pathway to which they belong, remains unknown. In soybean were reported the presence of three ASRs, which were called GmASR1, and GmASR2 GmASR3. This study aimed to identify factors that interact with the GmASR3 promoter region, as well as factors that bind to the protein GmASR3. After analysis of databases, the promoter region about 500 bp upstream of the transcription initiation codon was obtained from PCR performed with genomic DNA from soybean (Glycine max), and cloned into plasmid pHIS2.1. This construct was transformed in yeast S. cerevisiae W303 for subsequent liquid screening of cDNAs that express factors capable of interacting with the promoter GmASR3 by mono-hybrid yeast system. It was found that the protein GmASR3 has weak transactivation capacity under the used conditions, which enabled the realization of two-hybrid experiments to identify factors that bind to the protein GmASR3.The factors that bind to GmASR3 were obtained by two-hybrid system yeast, using for this yeast S. cerevisiae AH109 carrying the plasmid pDest32 which was inserted the cDNA sequence GmASR3. Likewise, the method of liquid screening in deep well plates was used. The colonies that were considered to have the factors that interact with the promoter or the protein in GmASR were re-transformed in E. coli Dh5α and sent for sequencing.