Understanding the functional role of the organic acids for stomatal movements and stress responses in Arabidopsis thaliana

Abstract

Organic acids (OAs) are central to cellular metabolism performing several functions: beyond their role as intermediates of the tricarboxylic acid cycle and precursors for the biosynthesis of other molecules, they are also a predominant part of root exudates, modulators of redox states between cellular compartments, and key regulators in the response of guard cells to environmental stimuli. In this thesis, we present distinct aspects of the complex regulation of OAs and how their transport mediates stomatal movements in guard cells. We initially summarize the current molecular advances underlying the complex regulation of stomatal development and movements to dynamic environmental conditions. In doing so, we were able to showcase that (i) stomatal closure in response to abscisic acid (ABA) depends on the disassembly of microtubules by the degradation of a stabilizing protein during the stomatal opening, (ii) sucrose supply in short days results in the accumulation of an conserved energy sensor kinase that promotes stomatal development, and (iii) that production of a non-protein amino acid gamma-aminobutyric acid (GABA) is necessary to reduce stomatal opening and transpirational loss through down-regulation of a vacuolar anion transporter (ALMT9) of stomatal cells in response to drought. In chapter 3, we addressed the importance of OAs for plant performance in the context of mitochondrial and guard cell metabolism under abiotic stress conditions. Accordingly, we reviewed the role of OAs as root chelating agent, in biosynthesis of stress signaling and osmoregulatory solutes during stomatal movements. We conclude that plants use different mechanisms to regulate and accumulate OAs, depending on the cell organ, cell compartment, and stress condition, allowing the proper functioning of physiological and biochemical responses in plants following stress conditions. In chapter 4, to obtain a more comprehensive picture of the vacuolar transport of OAs in guard cells, we analyzed how the impaired malate accumulation impacts effects on stomatal behavior, photosynthetic capacity and primary metabolism in leaves of plants with individual and combined repression of tonoplast dicarboxylate transporter (tDT), ALMT6 and ALMT4 channels. Briefly, the results presented here provide evidence on (i) the inefficiency of stomatal opening caused by ALMT6 repression in almt6, almt6 tdt-1 and almt6 almt4 lines suggesting that, ALMT6 compensates for vacuolar malate transport in guard cells upon tDT repression with respect to the stomatal opening. However, tDT and ALMT4 are important in the proper storage of dicarboxylates in the vacuole of mesophyll cells. In addition, (ii) we also observed that almt6 almt4 plants maintained growth by increasing dark respiration and sugar accumulation, whereas in almt6 and almt4 plants this accumulation maintained respiration rates, with unchanged and impaired growth, respectively; (iii) repression of ALMT6 and ALMT4 channels led to slower stomatal kinetics and lower stomatal conductance, highlighting the importance of ALMT6 for stomatal opening, and that non-functional ALMT4 likely downregulates the activity of other ion and solute transport channels in guard cells during stomatal opening. Despite that, we did not observe effects on stomatal behavior under high CO 2 , and, as a result, all mutants were responsive to ABA during stomatal closure, indicating the possible activity of OAs and other ion channels in the guard cell plasma membrane. Future analyses are required to determine if alternative ALMT family members and/or others ions transporters are functioning at guard cell transcriptional levels. This input knowledge will be necessary for a better understanding of the mechanisms used to bypass the impaired accumulation of organic acids in these plants. Keywords: Environmental stress. Mitochondrial metabolism. Vacuolar transport. Organic acids. Respiration. Stomata.

Os ácidos orgânicos (AOs) são fundamentais para o metabolismo celular desempenhando diversas funções: além de seu papel como intermediários do ciclo dos ácidos tricarboxílicos na produção de poder redutor e precursores para a biossíntese de outras moléculas, eles também são parte predominante dos exsudados radiculares, capazes de modular os estados redox entre os compartimentos celulares e estão envolvidos como reguladores chaves na resposta das células guarda aos estímulos ambientais. Nesta tese, apresentamos aspectos distintos da complexa regulamentação dos AOs e como o seu transporte medeia os movimentos estomáticos em células guarda. Inicialmente reunimos os avanços moleculares subjacentes à complexa regulamentação do desenvolvimento e movimentos estomáticos para condições ambientais dinâmicas. Ao fazer isso, conseguimos demonstrarque (i) o fechamento estomático em resposta ao ácido abscísico (ABA) depende da desmontagem dos microtúbulos pela degradação de uma proteína estabilizadora durante a abertura estomática, (ii) o fornecimento de sacarose em dias curtos resulta no acúmulo de uma quinase sensorial conservada de energia que promove o desenvolvimento estomático, e (iii) que a produção de um aminoácido não proteico ácido- aminobutírico (GABA) é necessária e suficiente para reduzir a abertura estomática e perda transpiracional através da desregulamentação de um transportador vacuolar de ânions (ALMT9) de células estomáticas em resposta à seca. Além disso, fornecemos novos conhecimentos sobre a sinalização energética e formação dos estômatos, bem como a regulamentação dos movimentos estomáticos e mecanismos moleculares para o estresse ambiental nas plantas. No capítulo 3, abordamos a importância dos AOs para o desempenho das plantas em um contexto de metabolismo mitocondrial e de célula guarda sob condições de estresse abiótico. Dessa forma, revisamos o papel dos AOs na tolerância ao alumínio como agentes quelantes radiculares, na biossíntese da sinalização de estresse e solutos osmorregulatórios durante os movimentos estomáticos. Concluímos que as plantas utilizam de diferentes mecanismos para regular e acumular AOs, dependendo do órgão celular, do compartimento celular e da condição de estresse, permitindo o funcionamento adequado das respostas fisiológicas e bioquímicas nas plantas após condições de estresse. No capítulo 4, para obter um quadro mais abrangente do transporte vacuolar de AOs em células guarda, analisamos como o acúmulo prejudicado de malato impacta nos efeitos sobre o comportamento estomático, a capacidade fotossintética e metabolismo primário em folhas de plantas com repressão individual e combinada do transportador de dicarboxilatos do tonoplasto (tDT), ALMT6 e ALMT4. Resumidamente, os resultados aqui apresentados fornecem evidências sobre (i) a ineficiência da abertura estomática causadas pela repressão de ALMT6 em linhas almt6, almt6 tdt-1 e almt6 almt4, sugerindo que, ALMT6 compensa o transporte de malato vacuolar em células guarda em relação a repressão de tDT no que respeita a abertura estomática. Entretanto, tDT e ALMT4 são importantes no armazenamento adequado de dicarboxilatos no vacúolo das células mesofílicas; (ii) observamos também que plantas almt6 almt4 mantiveram o crescimento aumentando a respiração noturna e acúmulo de açucares, enquanto que em plantas almt6 e almt4 este acúmulo manteve as taxas respiratórias, com crescimento inalterado e prejudicado, respectivamente; (iii) a repressão dos canais ALMT6 e ALMT4 levou a uma cinética estomática mais baixa, destacando a importância de ALMT6 para a abertura estomática, e que ALMT4 não funcional desregula a atividade de outros canais de transporte de íons e solutos em células guarda durante a abertura estomática. Apesar disso, não observamos efeitos sobre o comportamento estomático sob alto nível de CO 2 e, como resultado, todos os mutantes foram responsivos ao ABA durante o fechamento estomático, indicando a possível atividade dos AOs e outros canais de íons na membrana plasmática da célula guarda. Análises futuras são necessárias para determinar se os membros alternativos da família ALMT e/ou outros transportadores de íons estão funcionando em níveis de células guarda e de transcrição. Esse conhecimento de entrada será necessário para uma melhor compreensão dos mecanismos usados para contornar o acúmulo prejudicado de ácidos orgânicos nessas plantas. Palavras-chave: Estresse ambiental. Metabolismo mitocondrial. Transporte vacuolar. Ácidos orgânicos. Respiração. Estômato.