Efeito do Bovine alphaherpesvirus 1 no desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro naturalmente e artificialmente infectados

Abstract

O bovine alphaherpesvirus 1 (BHV1]) é um agente que encontra-se amplamente disseminado nos rebanhos bovinos de corte e leite no Brasil e no mundo. Sua reconhecida capacidade de transmissão por meio das biotécnicas reprodutivas de manipulação das células germinativas masculinas e femininas, como a produção in vitro de embriões, atrai atenção especial tendo em vista a vasta e crescente difusão dessa técnica na bovinocultura. Essa infecção viral é responsável por prejuízos à pecuária mundial que estão relacionados principalmente aos aspectos reprodutivos. Esse estudo, dividido em dois capítulos, teve por objetivo avaliar os efeitos do BHVI sobre o desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro em modelo de infecção natural e artificial. Além disso, analisou-se também a expressão de transcritos relacionados à apoptose celular, estresse oxidativo, remodelamento gênico e desenvolvimento embrionário, bem como investigou-se a presença e localização viral nos embriões produzidos. Para os procedimentos experimentais, foram coletados sangue e ovários de fêmeas bovinas provindas de rebanhos sabidamente sem histórico de vacinação contra o BHV1. O capítulo I abrangeu o estudo de ovócitos de doadoras não vacinadas mas naturalmente infectadas. Já no capítulo II, ovócitos de animais soronegativos para o BHV1 foram artificialmente expostos ao vírus em diferentes etapas: (1) durante a etapa de maturação (2) fecundação e (3) cultivo, além do (4) grupo controle. No capítulo I, menor taxa de produção de embriões viáveis (13,66 %) foi observado no grupo de doadoras soropositivas (P<0,05) quando comparado com a obtida em doadoras soronegativas (21,27 %). Embriões oriundos de animais soropositivos, anda que considerados viáveis, tiveram maior expressão da caspase 2, gene envolvido no processo de apoptose. Diferença significante também foi observada para taxa de produção de embriões inviáveis, sendo menor no grupo de doadoras soronegativas (9,52 %). No teste de imunofluorescência, não foram identificadas partículas de BHVI em embriões de doadoras soronegativas, mas em 7/31 (22,58 Y%) dos embriões de doadoras soropositivas foi identificado o BHVI. No capítulo II, verificou-se redução (P<0,05) na taxa de clivagem do grupo 1 quando comparado ao grupo controle. O grupo de infecção durante o cultivo (3) foi o mais afetado quanto as taxas de produção de embriões viáveis e inviáveis (9,84 e 45,35 %) comparado ao grupo controle (57,14 e 9,30 %). A infecção artificial pelo BHV1 ocasionou também efeitos (P<0,05) no aumento da expressão dos genes APAFI e CASP2, envolvidos no processo de apoptose celular, e dos genes DNMT3B, GJAI E FGF9 relacionados ao remodelamento gênico e desenvolvimento embrionário. Diante disso, conclui-se que o BHV1 foi capaz de afetar negativamente o desenvolvimento in vitro de ovócitos e embriões tanto nas condições de infecção in vitro e especialmente em condições naturais de infecção, elucidando o menor desempenho reprodutivo observado desses animais. Palavras-chave: Apoptose. Blastocisto. Cultivo in vitro. Imunofluorescência. Vírus.

Bovine alphaherpesvirus 1 1s widely disseminated 1n beef and dairy cattle herds in Brazil and worldwide. Its recognized ability of transmission through reproductive biotechniques such as the in vitro embryo production, attracted special attention in view of the dissemination of this technique in cattle breeding. This viral infection 1s responsible for important livestock losses worldwide that are mainly related to reproductive aspects. This study, divided into two chapters, aimed to evaluate the effects of bovine alphaherpesvirus 1 (BHV1) on the development of in vitro produced bovine embryos 1n a natural and artificial infection model. In addition, the expression of transcripts related to cell apoptosis, oxidative stress, genomic remodeling and embryonic development was also analyzed, as well as the presence and viral localization. For the experimental procedures, blood and ovaries were collected from slaughterhouse cows unvaccinated against BHV1. Chapter I covered the study of naturally infected oocytes from unvaccinated donors, while in Chapter II, oocytes from seronegative animals were artificially exposed to the virus at different stages (1) during the in vitro maturation stage, (2) in vitro fertilization, (3) in vitro culture, and (4) control group. In chapter I, a lower viable embryos rate (13.66 %) was observed 1n the group of seropositive donors (P<0.05) when compared with that obtained in seronegative donors (21.27 %). Embryos from seropositive animals, although considered viable, had a higher expression of caspase 2, a gene involved mn the apoptosis process. A significant difference was also observed for the non- viable embryos rate, being lower im the group of seronegative donors (9.52 %). In the immunofluorescence test, BHV1 particles from seronegative donor embryos were not identified, but BHV1 was identified in 7/31 (22.58 %) of the embryos from seropositive donors. In chapter II, there was a significant reduction (P<0.05) in the cleavage rate of group | when compared to the control group. The infection group during in vitro culture (3) was the most affected in terms of the viable and non-viable embryos rates (9.84 and 45.35 Y%) compared to the control group (57.14 and 9.30 %). The artificial infection by BHVI also caused effects (P<0.05) im the increase of the expression of APAFI and CASP2 genes, involved 1n the cell apoptosis process, and of the DNMT3B, GJAÍ and FGF9 genes, related to gene remodeling and embryonic development. In view of this, 1t 1s concluded that BHV1 was able to impairs the in vitro development of oocytes and embryos both in in vitro infection conditions and especially in natural infection conditions, elucidating the lower reproductive performance observed 1n these animals. Keywords: Apoptosis. Blastocyst. Immunofluorescence. In vitro culture. Virus.