Caracterização bioquímica e estudos estrutural e termodinâmico de α-galactosidases de Debaryomyces hansenii UFV-1

Abstract

O consumo humano de produtos derivados da soja foi limitado pela presença de oligossacarídeos não digeríveis, tais como os α-galacto-oligossacarídeos rafinose e estaquiose (GO). A maioria dos mamíferos, incluindo o homem, não possui α-galactosidase pancreática, necessária para a hidrólise destes açúcares. Entretanto, os GO podem ser fermentados por microrganismos presentes no intestino grosso, produzindo gases, que podem induzir flatulência e outras desordens gastrintestinais. A utilização de microrganismos que expressam α-galactosidase é uma solução promissora à eliminação dos GO, antes que estes alcancem o intestino grosso. No estudo atual, nós relatamos a produção e a purificação das α- galactosidases extracelular e intracelular de Debaryomyces hansenii UFV-1, para estudos de caracterizações moleculares (dicroísmo circular) e cinético-bioquímicas destas enzimas. Nós também realizamos análises termodinâmicas usando a microcalorimetria (DSC), visando o melhor conhecimento das características individuais de cada α-galactosidase, com a finalidade de utilizar estas enzimas na eliminação dos GO em produtos derivados da soja. Células de Debaryomyces hansenii UFV-1, cultivadas em galactose como fonte de carbono, produziram α-galactosidases extracelular e intracelular, com massas moleculares de 54,5 e 54,8 kDa (MALDI-TOF), 60 e 61 kDa (SDS-PAGE), e valores de pI de 5,15 e 4,15, respectivamente. α-Galactosidases extracelular e intracelular desglicosiladas apresentaram massas moleculares de 36 e 40 kDa, com conteúdo de carboidrato de 40 e 34 %, respectivamente. As seqüências do N-terminal das α-galactosidases foram idênticas. α-Galactosidases intracelular e extracelular de D. hansenii UFV-1 mostraram poucas variações em seus conteúdos de aminoácidos. α-Galactosidase intracelular mostrou menor termoestabilidade quando comparada com a enzima extracelular. α-Galactosidase extracelular de D. hansenii UFV-1 apresentou maior Kcat do que a enzima intracelular (7,16 vs 3,29 s-1, respectivamente), para o substrato pNPαGal. O valores de Kcat da enzima intracelular para melibiose, estaquiose e rafinose foram 0,03, 6,05 e 4,12 s-1, respectivamente. Incubação da isoforma intracelular com extrato hidrossolúvel da soja por 6 h a 55 oC reduziu os teores de estaquiose e rafinose em 100 e 73 %, respectivamente. Pode-se observar que, a α-galactosidase de D. hansenii UFV-1 foi eficiente na redução dos GO presentes em produtos derivados da soja, e é apropriada para uso industrial no processamento destes açúcares. Derivados de galactopiranosídeos foram sintetizados para explicar atividades inibitórias das α-galactosidases de D. hansenii UFV-1. α- D-Galactopiranosídeo de metila foi o inibidor mais potente comparado aos demais testados, com valores de Ki de 0,82 e 1,12 mM, para as enzimas extracelular e intracelular, respectivamente. A presença do grupo hidroxila na posição C-6 foi importante para o reconhecimento pelas α-galactosidases de D. hansenii UFV-1. As glicoproteínas foram completamente hidrolisadas com 6 M de HCl a 80 °C, liberando os monossacarídeos após 2 h de incubação. A presença de galactose e manose foram observadas na α-galactosidase extracelular e xilose na enzima intracelular. Propriedades espectroscópicas, cinéticas e termodinâmicas foram determinadas para α-galactosidases de D. hansenii UFV-1. Efeitos de pH e temperatura na estrutura destas enzimas foram investigadas usando Dicroísmo Circular (CD). α-Galactosidases de D. hansenii UFV-1 apresentaram composições de estruturas secundárias (α-hélice, folhas-β paralelas e voltas-β) semelhantes. Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) foi utilizada para a determinação de alguns parâmetros termodinâmicos durante desnaturação térmica protéica. Imediatamente, não foi observada reversibilidade da desnaturação térmica para α-galactosidases de D. hansenii UFV-1, entretanto, ocorreu como um processo termodinamicamente controlado. α-Galactosidase extracelular, em pH 5,5, mostrou um valor de Tm menor (86,1 °C) quando comparado com a enzima intracelular (87,3 °C). O índice relativo de cooperatividade para a α-galactosidase intracelular (ΔT1/2 = 5,0 ºC) foi menor do que para a enzima extracelular (ΔT1/2 = 5,6 ºC). Assim, os dados de CD e DSC sugerem que, as duas enzimas tenham comportamentos diferentes e discretos, embora possuam estrutura secundária similar. A energia de ativação de Arrhenius reportada para as α- galactosidases extracelular e intracelular de D. hansenii UFV-1 (88 e 95 KJ/mol, respectivamente) foi correspondentemente elevada e indica uma mudança química transiente considerável durante o processo de ligação. As condições testadas para a cristalização da α- galactosidase extracelular de D. hansenii UFV-1 foram os Kits 1 e 2 (Crystal Screen), utilizando a técnica da difusão de vapor em gota suspensa. Em determinadas condições houve aparecimento de cristais, entretanto, análises de difração em raios-X indicaram a formação dos sais usados na cristalização.

Human consumption of soy-derived products has been limited by the presence of nondigestible oligosaccharide, such as the α-galacto-oligosaccharides raffinose and stachyose (GO). Most mammals, including man, lack pancreatic α-galactosidase, which is necessary for the hydrolysis of these sugars. However, GO can be fermented by gas-producing microorganisms present in the large intestine, which in turn can induce flatulence and other gastrointestinal disorders. The use of microorganisms expressing α-galactosidase is promising solution to the elimination of GO before they reach the large intestine. In the present study, we reported the production and purification of Debaryomyces hansenii UFV-1 extracellular and intracellular αα-galactosidases, for studies of molecular (circular dichroism) and kineticbiochemical characterizations of these enzymes. We also performed the thermodynamic analysis using microcalorimetry (DSC), aiming for better knowing the individual characteristics of each α-galactosidase, with the purpose for using these enzymes in the elimination of the GO in soy-derived products. Debaryomyces hansenii UFV-1 cells, cultivated on galactose as carbon source, produced extracellular and intracellular α- galactosidases, with 54.5 and 54.8 kDa molecular mass (MALDI-TOF), 60 and 61 kDa (SDSPAGE), and 5.15 and 4.15 pI values, respectively. Extracellular and intracellular α- galactosidases deglycosylated presented 36 and 40 kDa molecular mass, with 40 and 34 % carbohydrate content, respectively. The N-terminal sequences of the α-galactosidases were identical. Amino acid analysis from D. hansenii UFV-1 intracellular and extracellular α- galactosidases showed few variations in their contents. Intracellular α-galactosidase showed smaller thermostability when compared to the extracellular enzyme. D. hansenii UFV-1 extracellular α-galactosidase presented higher Kcat than the intracellular enzyme (7.16 vs 3.29 s-1, respectively), for the pNPαGal substrate. The intracellular enzyme Kcat values for melibiose, stachyose, and raffinose were 0.03, 6.05 and 4.12 s-1, respectively. Incubation of intracellular isoform with soymilk for 6 h at 55 oC reduced stachyose and raffinose amounts by 100 and 73 %, respectively. It can be observed that D. hansenii UFV-1 α-galactosidase was efficient in reducing the GO presents in soy-derived products, and it is appropriate for industrial use in the processing of these sugars. α-D-Galactopyranosides derivatives were synthesized for elucidate inhibitory activities of D. hansenii UFV-1 α-galactosidases. Methyl α-D-galactopyranoside was the most potent inhibitor compared to the others tested, with Ki values of 0.82 and 1.12 mM, for extracellular and intracellular enzymes, respectively. The presence of hydroxyl group in the C-6 position was important for the recognition by D. hansenii UFV-1 α-galactosidases. The glycoproteins were completely hydrolyzed with 6 M HCl at 80 °C, releasing the monosaccharides after 2 h of incubation. The presence of galactose and mannose was observed in the extracellular α-galactosidase and xylose in the intracellular enzyme. Spectroscopic, kinetic and thermodynamic properties were determined for D. hansenii UFV-1 α-galactosidases. Effects of pH and temperature on the structure of these enzymes were investigated using Circular Dichroism (CD). D. hansenii UFV-1 α- galactosidases showed very similar secondary structure compositions (α-helix, β-sheet paralel and β-turn). Differential Scanning Calorimetry (DSC) was employed for the determination of some thermodynamic parameters during protein denaturation. Thermal denaturation reversibility was not immediately observed for D. hansenii UFV-1 α-galactosidases; however it occurred as a thermodynamically controlled process. Extracellular α-galactosidase, at pH 5.5, showed a Tm value smaller (86.1 °C) when compared to the intracellular enzyme (87.3 °C). The cooperativity relative index for intracellular α-galactosidase (ΔT1/2 = 5.0 ºC) was smaller than that of the extracellular enzyme (ΔT1/2 = 5.6 ºC). Thus, the CD and DSC data suggest that the two enzymes have different and discrete behaviors although they possess similar secondary structure. The related Arrhenius activation energy for extracellular and intracellular α-galactosidase from D. hansenii UFV-1 (88 and 95 KJ/mol, respectively) was correspondingly high and indicates a considerable transient chemical change during the binding process. The conditions tested for D. hansenii UFV-1 extracellular α-galactosidase crystallization were the Kits 1 and 2 (Crystal Screen) using the vapor diffusion technique in hanging drop. It had crystal appearance in determined conditions; however, the X-ray diffraction analysis had indicated salts formation used in the crystallization.