Identificação de genes que codificam proteínas secretadas por Puccinia psidii, agente etiológico da ferrugem das mirtáceas

Abstract

A ferrugem causada pelo basidiomiceto Puccinia psidii é uma das doenças mais destrutivas da cultura do eucalipto no Brasil, e motivo de restrições sanitárias onde a doença ainda não ocorre na Ásia e Oceania. Durante a interação com o hospedeiro os fungos biotróficos, como as ferrugens, secretam proteínas efetoras envolvidas na supressão da resposta de defesa e na manipulação do metabolismo do hospedeiro. Uma estratégia que pode ser utilizada para descoberta dessas proteínas é a predição in silico de sequências de exportação celular em sequências abertas de leitura deduzidas a partir do sequenciamento de cDNAs. O presente trabalho teve por objetivo identificar e caracterizar sequências de cDNAs de P. psidii que codificam proteínas secretadas por meio da análise de seqüências de uma biblioteca de cDNA construída a partir de mRNA isolado de folhas de Eucalyptus grandis infectadas por P. psidii. Foram analisadas 9864 etiquetas de seqüências expressas (ESTs). A partir de 1675 transcritos que codificam proteínas sem similaridade a sequências protéicas do banco não redundante do GenBank/NCBI e que não possuíam identidade a sequências de cDNA ou sequências genômicas depositadas em bancos de dados de eucalipto, foram obtidas 173 ORFs que apresentaram predição positiva em cinco ou mais parâmetros do algoritmo de predição de sequências sinal de exportação SignalP. Foi selecionado um subgrupo de 31 clones com melhores valores de predição de exportação celular em diferentes algoritmos para caracterização. Vinte e nove dos clones selecionados tiveram a região da ORF amplificada do genoma de P. psidii, gerando fragmentos iguais ou maiores aos amplificados a partir do cDNA. Oito clones apresentaram similaridade a seqüências de Puccinia graminis e cinco a sequências de Melampsora laricis, dentre as quais, quatro têm similares em ambos os bancos. Os clones selecionados também foram comparados entre si utilizando o programa BlastP, e apresentaram similaridade, variando desde pequenos motivos compartilhados a extensa identidade. Foi confirmada a secreção in vitro das proteínas codificadas por 24 clones pelo sistema de armadilha de sinal de secreção em levedura (YST). Vinte clones tiveram sua ORF clonada em um vetor para expressão transiente mediada por Agrobacterium. Análises de expressão transiente e do monitoramento da expressão das proteínas secretadas estão sendo otimizados para investigação do papel efetor das proteínas hipotéticas identificadas.

The rust caused by the basidiomycete Puccinia psidii is one of the most destructive diseases of eucalipty plantations in Brazil, and cause for sanitary barriers where this disease does not occur in Asia and Oceania. During the interaction with the host the biotrophic fungi, such as rusts, secrete effector proteins involved in the suppression of the defense response and in the manipulation of the host metabolism. A strategy that can be used to discovery of these proteins is the in silico prediction of cellular sequences export in open reading frames deduced from cDNA sequencing. This study aimed to identify and characterize cDNA sequences of P. psidii that encode secreted proteins through sequence analysis of a cDNA library constructed from mRNA isolated from Eucalyptus grandis leaves infected by P. psidii. We analyzed 9,864 expressed sequence tags (ESTs). From 1,675 transcripts that encode proteins with no similarity to protein sequences of non-redundant GenBank/NCBI database and lacked identity to cDNA or genome sequences deposited in the eucalipty databases, 173 ORFs that showed positive prediction in five or more parameters of the export signal sequence prediction algorithm SignalP were obtained. A subgroup of 31 clones with better predictive value of cell export in different algorithms was selected for characterization. Twenty-nine of the clones had the ORF amplified from the genome of P. psidii generating equal or larger fragments than those amplified from the cDNA. Eight clones showed sequences similarity to Puccinia graminis and five Melampsora laricis sequences, among which, four have similar in both banks. The selected clones were also compared with each other using the program BlastP, and presented similarity, ranging from small motifs shared to extensive identity. Secretion of proteins encoded for 24 clones was confirmed in vitro by the yeast secretion trap (YST). Twenty clones had their ORF cloned into a vector for Agrobacterium-mediated transient expression. Analysis of transient expression and expression monitoring of secreted proteins are being optimized to investigate the effector role of hypothetical proteins identified.