Identificação de componentes da via de sinalização mediada pela proteína NIK, um receptor que interage com a proteína NSP de geminivírus

Abstract

As proteínas da família das LRR-RLKs (receptor-like-quinases com repetições ricas em leucina) possuem uma relevância conceitual em eventos de sinalização mas, em plantas, a informação funcional ainda é restrita a alguns membros desta família. Os receptores NIK1, NIK2 e NIK3 de Arabidopsis thaliana pertecem à sub-familia LRRII-RLK e foram inicialmente identificados pela sua capacidade de interagir com a proteína NSP de geminivírus. Em resposta a um estímulo desconhecido, NSP-interacting kinases (NIKs) são ativadas após a formação de dímeros e autofosforilação intermolecular. A inibição da autofosforilação de NIK por NSP e a inativação de genes NIKs aumenta a suscetibilidade à infecção viral, sugerindo que esta proteína estaria envolvida em uma via de defesa contra a infecção por geminivírus. Os componentes downstream dessa via de sinalização, mediada pela proteína NIK, ainda não foram identificados. No presente estudo foi descrita a caracterização bioquímica e funcional de duas proteínas ribossomais, L10 e L18, as quais foram capazes de interagir com a proteína NIK através do sistema de duplo híbrido de leveduras. Estudos in vitro demonstraram que a proteína NIK é capaz de fosforilar a proteína L10, mas não L18. Entre os membros da família LRRII-RLK, a proteína NIK2 fosforila L10, enquanto NIK3 apresenta uma baixa capacidade de fosforilação do substrato. No entanto, a proteína de desenvolvimento SERK1 não utiliza L10 como substrato. Ensaios de expressão transiente, em plantas de tabaco, revelaram que a proteína L18 está localizada no citoplasma, bem como ao redor do núcleo e no nucléolo de algumas células. Por sua vez, em 97% das células, L10 foi localizada apenas no citoplasma, embora tenha sido encontrada no núcleo, em aproximadamente 3% das células observadas. A expressão transiente de NIK1 e NIK2 redireciona a proteína L10 para o núcleo em aproximadamente 30% das células. Em contraste, NIK3 não relocaliza a proteína L10 para o núcleo, e L18 não muda sua localização na presença das NIKs. Em plantas infectadas com TGMV, observou-se mudança apenas na localização citoplasmática de L10, acumulando-se em pontos do citoplasma quando não colocalizada com NIK. Para se comprovar geneticamente as interações de L10-NIK e L18- NIK, alelos nulos para os genes L10 e L18 de Arabidopsis, contendo inserção de T-DNA, foram obtidos e inoculados com o CaLCuV. A inativação dos genes L10 e L18 recapitulou o fenótipo de suscetibilidade aumentada de nik1 e as plantas knockout, principalmente l10, apresentaram sintomas severos e taxa de infecção alta quanto comparados com as plantas selvagens columbia. Os resultados deste trabalho são consistentes com um modelo que posiciona as proteínas ribossomais L10 e L18 como componentes funcionais da via de sinalização de defesa mediada pela proteína NIK, sendo L10 um componente imediatamente downstream ao receptor transmembrana.

Proteins of the family of LRR-RLKs (receptor-like-kinases with leucine-rich repeats) have a conceptual relevance in signaling events but in plants information regarding function is limited to a few members of this family. The receptors NIK1, NIK2 and NIK3 of Arabidopsis thaliana belong to the sub-family LRRII-RLK and were initially identified by their capacity to interact with the geminivirus NSP protein. In response to an unknown stimulus, NSP-interacting kinases (NIKs) are activated after the formation of dimmers and intermolecular autophosphorylation. The inhibition of autophosphorylation of NIK by NSP and the activation of NIK genes increase the susceptibility to viral infection, suggesting that this protein is involved in a defense pathway against geminivirus infection. The downstream components of this pathway, mediated by the protein NIK, have yet to be identified. In the present study, the biochemical and functional characterization of two ribosomal proteins, L10 and L18 were described, these being capable of interacting with the protein NIK via the yeast two-hybrid system. In vitro studies demonstrated that the protein NIK is capable of phosphorylating the protein L10, but not L18. Of the members of the LRRIIRLK family, the protein NIK2 phosphorylates L10, while NIK3 presents a low capacity for phosphorylation of the substrate. However, the development protein SERK1 does not use L10 as a substrate. Assays of transient expression in tobacco plants, revealed that the L18 protein is located in the cytoplasm, as well as around the nucleus and the nucleoli of some cells. In turn, in 97% of the cells, L10 was localized only in the cytoplasm, although it was also found in the nucleus, in approximately 3% of the observed cells. The transient expression of NIK1 and NIK2 redirects the L10 protein to the nucleus in approximately 30% of the cells. In contrast, NIK3 does not relocalize the L10 protein to the nucleus, and L18 does not change its localization in the presence of the NIKs. In plants infected with TGMV, a change only in the cytoplasmic localization of L10 was observed, accumulating in points of the cytoplasm when not co-localized with NIK. To prove genetically the interactions of L10-NIK and L18-NIK, null alleles for the genes L10 and L18 de Arabidopsis, containing T-DNA insertion, were obtained and inoculated with CaLCuV. The inactivation of the genes L10 and L18 restored the elevated susceptibility phenotype of nik1 and the knockout plants, principally l10, presented severe symptoms and high rates of infection when compared with the wild columbia plants. The results of this work are consistent with a model that places the ribosomal proteins L10 and L18 as functional components of the defense signaling pathway mediated by the protein NIK, L10 being a component immediately downstream of the transmembrane receptor.