Cultivo in vitro e embriogênese somática de embriões zigóticos de macaúba (Acrocomia aculeata (Jacq). Loddiges)

Abstract

O presente trabalho teve por objetivos a proposição de protocolos para a cultura de embriões e indução de embriogênese somática da macaúba, utilizando-se como fonte de explantes embriões zigóticos maduros e imaturos. Na cultura de embriões in vitro estudou-se: a) o efeito do regime de incubação e carvão ativado na germinação de embriões maduros; b) o efeito da composição do meio, concentração de sais, e do carvão ativado na germinação de embriões zigóticos maduros e imaturos; c) o efeito de temperaturas de armazenamento dos frutos e da sacarose na germinação in vitro de embriões zigóticos maduros e imaturos. Quanto à indução de embriogênese somática, avaliou-se o efeito da auxina picloram na indução de calos embriogênicos, a partir de embriões zigóticos maduros. Nos experimentos de germinação in vitro de embriões zigóticos, avaliaram-se os percentuais de intumescimento, oxidação, germinação, explantes sem reação, conversão de plântulas viáveis, plantas com raízes secundárias, comprimento da parte aérea e da raiz primária e o número médio de folhas por plântula. Na indução de embriogênese somática, foram avaliados os percentuais de calejamento dos explantes, o tipo de calo formado (primário ou embriogênico), o percentual de calos nodulares e a oxidação. O cultivo dos embriões sob fotoperíodo resultou em elevado índice de oxidação dos explantes, no entanto foi favorável ao crescimento e desenvolvimento das plântulas se comparados ao regime de escuro inicial. A suplementação do meio com carvão ativado mostrou-se imprescindível ao pleno desenvolvimento das plântulas, principalmente por estimular o desenvolvimento de um sistema radicular eficiente, visto que na ausência deste componente no meio, não foi observada a conversão de plântulas viáveis, que por sua vez apresentaram crescimento lento e desbalanceado. Em relação à composição do meio, em geral o meio de MS promoveu resultados ligeiramente superiores ao meio Y3, em termos de desenvolvimento das plântulas, na ausência de carvão ativado. Contudo, independente da composição salina utilizada, a ausência de carvão no meio resultou no crescimento desbalanceado das plântulas, que nessa condição, não apresentaram formação de raízes primárias e secundárias. Por outro lado, a incorporação de carvão ativado aos meios, promoveu a conversão de plântulas viáveis, com raízes bem formadas, e em condições de serem aclimatizadas. Plântulas oriundas da cultura de embriões imaturos tenderam a se desenvolver melhor em meio contendo maiores concentrações de sais (75 e 100 % da força total) do meio Y3. Além disso, notou-se que as raízes primárias tiveram maior alongamento e desenvolvimento de raízes secundárias, à medida que a concentração de carvão ativado no meio foi aumentada. Quanto ao armazenamento dos frutos, a temperatura ambiente incorreu em maior percentual de germinação dos embriões. A menor concentração de sacarose foi o pior tratamento, pois além de influenciar negativamente a germinação dos embriões, especialmente para os frutos mantidos em baixa temperatura, resultou na formação de plântulas anormais, com sintomas de hiperidricidade. Nas concentrações mais elevadas de sacarose, não foi observada diferença no aspecto das plântulas, que mostraram-se muito vigorosas, independente da temperatura em que os frutos foram estocados. A temperatura de 35 ºC estimulou a germinação dos embriões imaturos e a conversão de plântulas viáveis, e, independente do tempo em que os frutos permaneceram nessa condição a qualidade fisiológica e viabilidade dos explantes foi mantida. Além disso, proporcionou maior eficiência durante o processamento dos frutos e extração dos embriões. A freqüência de calos embriogênicos foi maior em meio contendo 2,4 mg L-1 de picloram, que também mostrou-se mais efetiva na formação de estruturas nodulares. Seções histológicas de calos nodulares revelaram a formação de pró-embriões e embriões somáticos na fase globular, contudo essas estruturas não progrediram para fases mais avançadas quando transferidas para meio de maturação, e os calos tenderam a escurecer por completo após 30 dias nessa condição. Os resultados obtidos nesse trabalho permitiram concluir que é possível obter plântulas de macaúba a partir da cultura de embriões in vitro de forma relativamente rápida (12 semanas). No entanto, estudos complementares visando, principalmente, aprimorar a fase de aclimatização devem ser conduzidos, considerando o crescimento lento apresentado, o que demonstra a dificuldade de enraizamento in vitro da espécie. Pesquisas mais aprofundadas nesse sentido contribuirão para aumentar a sobrevivência das plântulas nessa fase e com isso viabilizar a aplicação desta técnica na propagação da macaúba. Metodologias que visem a melhoria da fase de maturação e regeneração de embriões somáticos necessitam ser ajustadas, permitindo a clonagem em larga escala desta palmeira, via embriogênese somática, pelo seu potencial como oleaginosa na produção de biocombustíveis.

The objectives of this work were to propose the proceeds regarding the culture of embryos and induction of somatic embryogenesis of the Acrocomia aculeata palm tree using as explants source the mature and immature zygotic embryos. In the in vitro embryo culture the following were studied: a) the effect of the incubation conditions and of the activated charcoal on the germination of the mature embryos; b) the effect of the medium composition, salt composition and of the activated charcoal on the germination of mature and immature zygotic embryos; and c) the effect of the storage temperature of the fruits and of the sucrose on the in vitro germination of mature and immature zygotic embryos. In relation to the induction of somatic embryogenesis, the effect of the auxin picloram in the induction of embryogenic calluses was evaluated on mature zygotic embryos. In the experiments on in vitro germination of zygotic embryos, the percentage of swelling, oxidation, germination, non reative explants, conversion to viable seedlings, plants with secondary roots, length of the aerial part and of the primary root and the average number of leaves per seedlings were evaluated. In the induction of somatic embryogenesis, the percentages of callus formation on the explants, the type of callus formed (primary or embryogenic), the percentage of nodular callus and the oxidation were evaluated. The culture of embryos under photoperiodic conditions resulted in a high index of oxidation of the explants, but this was favorable to the growth and development of the seedlings if compared to the starting darkness condition. The addition of activated charcoal to the medium showed to be essential to the complete development of the seedlings, mainly because it stimulates the development of an efficient root system, because in the absence of this component in the medium the conversion to the viable seedling was not observed, instead, the seedlings had a slow and unbalanced growth. In relation to the medium composition, in general, the MS medium promoted slightly better results than the Y3 medium, considering the seedling development in the absence of the activated charcoal. However, independent of the saline composition used, the absence of activated charcoal in the medium resulted in the unbalanced growth of the seedlings, which, in this condition, did not show the formation of primary or secondary roots. On the other hand, the addition of activated charcoal to the media promoted the conversion to viable seedlings, with well formed roots and in conditions to grow normally. The seedlings produced from immature embryos had the tendency to develop better in a medium with higher salt concentrations (75 to 100 % of the total power) of the Y3 medium. Moreover, it was observed that the primary roots had a greater length and developed more secondary roots as the concentration of activated charcoal was increased in the medium. In relation to the storage of the fruits, the environmental temperature caused the greatest percentage of germination of the embryos. The lower concentration of sucrose was the worst treatment, because, besides influencing negatively the germination of the embryos, specially those from fruits kept in low temperature, it resulted in the formation of abnormal seedlings, with symptoms of hyperhydricity. In the higher sucrose concentrations no difference was observed in the aspects of the seedlings, that showed great vigour, independently of the storage temperature of the fruits. The temperature of 35 oC stimulated the germination of immature embryos and the formation of viable seedlings, and, independent of the period of time that the fruits were kept in this condition, the physiologic quality and the viability of the explants were maintained. In addition, it rendered greater efficiency during the processing of the fruits and the extraction of the embryos. The frequency of the embryogenic calluses was greater in the medium containing 2,4 mg L-1 of picloram that also showed to be more effective in the formation of nodular structures. Hystologic sections of the nodular calluses showed the formation of pro-embryos and of somatic embryos in the globular phase, but the formation of these structures did not progress to more advanced phases when they were transferred to a maturation medium, and the calluses tended to darken completely after 30 days in this condition. The results obtained in this work allowed to conclude that it is possible to obtain seedlings of Acrocomia aculeata from the in vitro embryo culture in a relatively fast way (12 weeks). Nevertheless, complementary studies directed mainly to the curing of the seedlings should be done, because of the slow growth rate shown, which demonstrates the in vitro rooting difficulty of the species. More specific research in this direction will contribute to increase the survival rate of the seedlings in this phase and thus viabilize the application of this propagation technique to this palm species. The methodologies to improve the maturation phase and the regeneration of somatic embryos need to be adjusted, to allow the cloning in great numbers via somatic embryogenesis, because of the potential as oleaginous plant to produce biofuels.