Preparo e avaliação de material de referência para análise de Salmonella

Abstract

A utilização de Material de Referência (MR) na análise microbiológica de alimentos aumentou em todo o mundo, principalmente com a implantação de programas de controle e gestão da qualidade em laboratórios. A necessidade de padronização de métodos de análise faz aumentar a demanda por este tipo de material que permite determinar a precisão e repetibilidade dos dados experimentais. Este estudo teve como objetivo preparar MRs microbiológicos para análises quantitativa e qualitativa de Salmonella, avaliar a homogeneidade e estabilidade ao longo do tempo de estocagem e comparar a sensibilidade dos métodos de detecção de Salmonella. O estudo foi conduzido em duas etapas, a primeira com MR contendo, aproximadamente, 103 UFC/ g de células de Salmonella, submetidas ou não a condições de estresse nutricional e estocadas, por até 240 dias, a -20 °C. A segunda etapa consistiu no preparo de MR contendo, aproximadamente, 10 UFC/ g para comparação da sensibilidade das metodologias de detecção de Salmonella em alimentos. A homogeneidade e a estabilidade do MR contendo, aproximadamente, 103 UFC/ g foram avaliadas por meio do teste estatístico de T1, análise de regressão linear e ensaio de proficiência, enquanto que o MR feito com baixo número de células de Salmonella foi avaliado pelo teste estatístico de T2 e por meio do programa Epiinfo do Centro de Prevenção e Controle de Doenças dos EUA (CDC) para avaliação dos métodos de detecção de Salmonella neste material. O teste estatístico de T1 para o MR preparado com 103 UFC/ g demonstrou valores superiores aos recomendados para este tipo de material, o que indicou a necessidade de realização de novos estudos para melhoria da resistência de Salmonella às condições de desidratação e de estocagem. No entanto, o mesmo material apresentou-se homogêneo no ensaio de proficiência realizado por três diferentes laboratórios, obtendo-se o valor de σp de até 25 % como recomendado pelo Esquema de Avaliação de Desempenho na Análise de Alimentos do Reino Unido (FEPAS). Na análise de regressão linear constatou-se não haver diferença significativa entre os MRs produzidos com e sem células estressadas, apesar de ter sido evidente a tendência de declínio do número de células de Salmonella no material feito sem células estressadas, após 240 dias de estocagem a -20 °C. Para o MR preparado com 10 UFC/ g, o teste estatístico de T2 evidenciou resultados aceitáveis, após 60 dias de estocagem a 4 °C. Porções de 1 g deste MR foram avaliadas por três metodologias analíticas que incluíram o método convencional, o método imunoanalítico VIDAS® e PCR automatizado, pelo sistema BAX. Os resultados foram concordantes em todas as amostras analisadas nos dois primeiros métodos, com índice de Kappa igual a 1. O método de PCR apresentou concordância em aproximadamente 95 % com a metodologia convencional, com índice de Kappa igual a 0,64. Resultados falso-negativos foram observados em 5 % das amostras analisadas, quando utilizado o método de PCR, no entanto, este resultado não compromete a sensibilidade da técnica. Neste trabalho foram destacadas as vantagens do uso de metodologias rápidas de detecção de Salmonella em alimentos, que oferecem além de maior rapidez e praticidade para obtenção dos resultados, sensibilidade semelhante ao método convencional recomendado pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento do Brasil.

The use of Reference Material (RM) in microbiological food analyses increased around the world, mainly with the introduction of quality control and management programs in laboratories. The necessity of the standardization of analysis methods makes the demand for this type of material increase which allows the determination of precision and repeatability of the experimental data. This study aimed to prepare microbiological RMs for quantitative and qualitative analyses of Salmonella, to evaluate the homogeneity and stability of the material during storage time and to compare the sensitivity of the Salmonella detection methods. The study was performed in two stages. The first with RM containing approximately 103 CFU/ g of Salmonella cells, submitted or not to starvation and storage conditions, up until 240 days, at -20 °C. The second stage consisted of the RM preparation containing approximately 10 CFU/ g for comparison of the methodology sensibility of Salmonella detection in food. The RM homogeneity and stability containing approximately 103 CFU/ g was evaluated through the T1 statistical test, analysis of linear regression and proficiency test, while the RM performed with a low number of Salmonella cells was evaluated by the T2 statistical test and by the Epiinfo program of the Center for Disease Control (CDC) of the USA for the evaluation of the detection methods of Salmonella in this material. The T1 statistical test for the RM prepared with 103 CFU/ g demonstrated superior values to the recommended ones for this type of material, which indicated the necessity for new studies for the improvement of the Salmonella resistance to the dehydration and storage conditions. However, the same material presented itself homogeneous in the proficiency test performed by three different laboratories, when the σp value was obtained until 25 % as recommended by the Food Examination Performance Assessment Scheme (FEPAS) of the United Kingdom. In the linear regression analysis, no significant difference was noted between the RMs produced with and without stressed cells, in spite of the decline tendency of the number of Salmonella cells in the material made without stressed cells being obvious after 240 storage days at -20 °C. For the RM prepared with 10 CFU/ g, the T2 statistical test presented acceptable results, after 60 storage days at 4 °C. One gram servings of this RM were evaluated by three analytical methodologies which included the conventional method, the immunoanalytical method VIDAS® and automated PCR, by the BAX system. The results were consistent in all the analyzed samples in the first two methods, with a Kappa rate equal to 1. The PCR method presented an agreement in approximately 95 % to the conventional methodology, with a Kappa rate equal to 0.64. False-negative results were observed in 5% of the analyzed samples, when the PCR method was used. However, this result does not compromise the technique sensibility. This study demonstrated advantages of the quick methodology use of Salmonella detection in food, which offers, besides greater speed and practicality forgetting results, similar sensitivity to the conventional method recommended by Brazil´s Ministry of Agriculture.