Quantificação do conteúdo de DNA nuclear de Eucalyptus spp. por citometrias de fluxo e de imagem

Abstract

O gênero Eucalyptus, da família Myrtaceae, apresenta cerca de 800 espécies e vários híbridos naturais. Além da importância biológica, é de múltiplo interesse comercial, destacando-se na indústria farmacêutica e na produção de biomassa lenhosa. A quantificação do conteúdo de DNA nuclear é útil em estudos de relações filogenéticas. Também é uma informação importante no mapeamento de genomas. Para a determinação do conteúdo de DNA nuclear em plantas, a citometria de fluxo é considerada a metodologia mais utilizada. No entanto, os estudos com Eucalyptus apresentam diferenças entre os valores encontrados. Outra técnica cujos resultados permitem a determinação da quantidade de DNA nuclear é a citometria de imagem. O objetivo deste trabalho é reavaliar as divergências nas quantificações de DNA nuclear em Eucalyptus, pela aplicação das citometrias de fluxo e de imagem. As quantificações foram realizadas com o uso do citômetro de fluxo, associado à coloração com iodeto de propídeo, dos núcleos isolados. Os padrões de referência foram folhas de Raphanus sativus Saxa (1,11 pg), Lycopersicon esculentum Stupicke (1,96 pg) e hemácias de Gallus gallus Leghorn fêmea (2,33 pg). Histogramas da intensidade de fluorescência relativa foram obtidos após a análise dos núcleos isolados dos padrões internos combinados com E. globulus, E. grandis e E. urophylla. Os valores em pg de DNA nuclear encontrados para E. globulus e E. grandis foram de 1,39 e 1,41 (padrão R. sativus), 1,20 e 1,22 (padrão L. esculentum), e 1,05 e 1,09 (padrão G. gallus). A quantificação para E. urophylla foi de 1,01 pg (padrão G. gallus). As espécies de Eucalyptus analisadas não apresentaram diferenças entre si maiores que 5,4% no conteúdo de DNA do genoma em pg. Todavia, variações em uma única planta, resultantes dos diferentes padrões, apresentaram divergências de até 32%. A citometria de imagem, dos núcleos corados pela reação de Feulgen, foi realizada para analisar o conteúdo de DNA de E. globulus, cujos valores foram de 1,16 (padrão R. sativus) e 1,02 pg (padrão L. esculentum). O uso de fluorocromos (intercalantes ou base específicos) e a interferência de compostos secundários na coloração foram considerados pontos críticos na análise pela citometria de fluxo; além dos padrões de referência e dos coeficientes de variação para ambas as citometrias. Em todas as análises os maiores coeficientes de variação foram 3,80 (citometria de fluxo) e 4,83% (citometria de imagem). Pela comparação entre as metodologias aplicadas, demonstrou-se o valor mais elevado da estimativa do conteúdo de DNA nuclear em E. globulus via citometria de fluxo, cerca de 16% maior do que na citometria de imagem. As proporções entre os padrões vegetais continuaram as mesmas em ambas as citometrias. Embora a quantificação mais precisa de DNA nuclear em picogramas para E. globulus seja proveniente da citometria de fluxo das folhas, pelo valor do CV, a mais acurada foi considerada a média dos dados obtidos via citometria de imagem dos meristemas, cujo valor foi 1,09 pg DNA/2C.

The Eucalyptus genus of Myrtaceae family has about 800 species and some natural hybrids. Beyond the biological importance, it is of multiple commercial interests, being distinguished in the pharmaceutical industry and the production of pulp biomass. The quantification of the nuclear DNA content is useful in studies of phylogenetics. Also it is important information for genome mapping. For nuclear DNA content determination, flow cytometry is considered the most appropriate methodology. However, Eucalyptus studies present differences between values. Another technique whose results allow the determination of the nuclear DNA amount is the image cytometry. The objective of this work was to reevaluate the divergences in the measures of nuclear DNA in Eucalyptus, for the application of flow and image cytometries. The measures had been carried through with the use of flow cytometer and stain with propidium iodide, of the isolated nuclei. The reference standards were leaves of Raphanus sativus cv. Saxa (1.11 pg), Lycopersicon esculentum cv. Stupicke (1.96 pg) and Gallus gallus female Leghorn erythrocytes (2.33 pg). Histograms of relative fluorescence intensity have generated after analysis of the isolated nuclei of combined internal standards with E. globulus, E. grandis and E. urophylla. The values in pg of nuclear DNA found for E. globulus and E. grandis xhad been of 1.39 and 1.41 (standard R. sativus), 1.20 and 1.22 (standard L. esculentum), and 1,05 and 1,09 (standard G. gallus). The quantification for E. urophylla pg was of 1.01 (standard G. gallus). The Eucalyptus species analyzed did not present differences among themselves greater than 5.4% in genomic DNA content in pg. However, intraspecific variations in only one plant, resultant of the different standards, presented divergences of up to 32%. The image cytometry analyses, with Feulgen reaction stain nuclei, were carried out to analyze the E. globulus DNA content, whose values were of 1.16 (standard R. sativus) and 1.02 pg (standard L. esculentum). The fluorochrome use (DNA- intercalating or base specific) and the secondary compounds interference in the staining were considered critical points in the analysis for the flow cytometry; besides the standards of reference and the coefficients of variation for both the cytometries. In all the analyses the bigger variation coefficients were 3.80 (flow cytometry) and 4.83 (image cytometry). For the comparison between the applied methodologies, the increase of the estimate of the nuclear DNA content was confirmed in E. globulus by flow cytometry, about 16% greater as compared to image cytometry. The ratios between plant standards remained the same ones in both techniques. Although the most precise nuclear DNA quantification in picogramas for E. globulus was proceeding from flow cytometry of leaves, by CV value, the most accurate was considered the average of meristem image cytometry data, whose value was 1.09 pg DNA/2C.