Caracterização e diversidade genética de geminivírus associados ao tomateiro na região do Triângulo Mineiro

Abstract

Um complexo viral causando mosaico dourado e deformação (rugosidade) foliar em tomateiros na região do Triângulo Mineiro, MG, Brasil, foi obtido por meio de moscas brancas virulíferas, e denominado TGV-Ub1. Os vírus presentes neste complexo viral foram transmitidos via extrato vegetal tamponado (EVT) a partir de folhas de tomateiro para plantas de Nicotiana benthamiana. A análise via PCR utilizando oligonucleotídeos universais para o gênero Begomovirus indicou a amplificação de dois fragmentos distintos para o componente A e para o componente B, sugerindo que o complexo viral TGV-Ub1 é composto por dois vírus distintos. De fato, dois geminivírus foram purificados biologicamente a partir do complexo viral TGV-Ub1, e causaram em tomateiro sintomas de mosaico dourado suave, sem rugosidade. O complexo viral TGV--Ub1 infectou apenas plantas da família Solanaceae, incluindo várias espécies de Nicotiana e Solanum tuberosum, e excluindo S. melongena, S. gilo, Capsicum annuum e C. frutescens. Obtiveram-se 87 clones com cerca de 2.600 nucleotídeos a partir de folhas de tomateiro infectado pelo complexo viral TGV-Ub1. A comparação das seqüências completas de nucleotídeos dos clones pUb1-49 (DNA-A), pUb1-62 e pUb1-81 (ambos DNA-B) indicou que esses componentes pertencem a novos begomovírus. Com base em análise filogenética, esses componentes foram classificados como pertencente a um begomovírus do hemisfério ocidental. Os clones pUb1-49 e -81 possuem regiões comuns idênticas. Este vírus foi denominado Tomato rugose mosaic virus (TRMV). O clone pUb1-62 possui região comum distinta do TRMV e de todos os demais geminivírus descritos. O DNA-A cognato de pUb1-62 não foi encontrado. Clones contendo 1,5 cópia dos componentes genômicos clonados em pUb1-49, -62 e -81 foram construídos. A análise da infectividade desses clones em Santa Clara e em N. benthamiana, por meio de bombardeamento de partículas, demonstrou que a combinação dos clones correspondentes ao genoma do TRMV causou sintomas sistêmicos nos dois hospedeiros, semelhantes àqueles causados pelos isolados puros obtidos neste trabalho. A combinação dos clones pUb1-49 e -62 não resultou em infecção sistêmica, indicando que esses dois componentes não formam pseudo-recombinantes viáveis. O TRMV foi transmitido via EVT a partir de folhas de N. benthamiana para N. benthamiana, e, por enxertia para S. tuberosum e Datura stramonium. Amostras de tomateiro apresentando sintomas semelhantes a mosaico dourado foram coletadas em três municípios da região do Triângulo Mineiro. Análise via PCR indicou que 148 das 170 amostras coletadas estavam infectadas por begomovírus. Das amostras infectadas, apenas uma hibridizou a 68°C com sonda para o componente A do TRMV, 109 hibridizaram a 58°C com esta sonda e 39 não hibridizaram com esta sonda em nenhuma das duas temperaturas, indicando que a maioria das amostras continha geminivírus geneticamente relacionado ao TRMV. Os componentes TRMV-A e TRMV-B foram detectados, respectivamente, em plantas de Nicandra physaloides (joá de capote) e Phaseolus vulgaris (feijão comum) coletadas em lavouras de tomateiro. Análise genética baseada em PCR-RFLP de fragmentos amplificados a partir das amostras coletadas indicou a existência de um alto grau de diversidade genética de begomovírus em tomateiros da região do Triângulo Mineiro.

A viral complex causing golden mosaic and leaf distortion (rugosity) in tomato plants in the Triângulo Mineiro region, Minas Gerais, Brasil, was obtained from viruliferous whiteflies, and named TGV-Ub1. This viral complex was sap-transmitted from tomato leaves to Nicotiana benthamiana plants. PCR amplification using universal primers for the genus Begomovirus yielded two distinct fragments for the A and B components of the viral genome. This suggested that the TGV-Ub1 complex was composed of two distinct viruses. Indeed, two geminiviruses were biologically purified from the TGV-Ub1 complex, and shown to cause symptoms of mild golden mosaic with no rugosity on tomato plants. The TGV-Ub1 complex infected only plants in the Solanaceae, including several Nicotiana species and Solanum tuberosum, but excluding S. melongena, S. gilo, Capsicum annuum and C. frutescens. Eighty-seven clones corresponding to full-length (~2.600 nucleotides) viral genomes were obtained from tomato leaves infected with TGV-Ub1. Comparisons of the complete nucleotide sequences of clones pUb1-49 (DNA-A), pUb1-62 and pUb1-81 (both DNA-B) indicated that they comprise new begomoviruses. By phylogenetic analysis, these components were identified as belonging to a begomovirus from the western hemisphere. Clones pUb1-49 and -81 showed identical common regions. This virus was named Tomato rugose mosaic virus (TRMV). Clone pUb1-62 has a distinct common region from TRMV and all other known geminiviruses. A cognate DNA-A for pUb1-62 was not found. Clones containing 1.5 copies of the genomic components cloned in pUb1-49, -62 and -81 were constructed. Infectivity analysis of these clones in Santa Clara and N. benthamiana plants using particle bombardment demonstrated that the combination of clones corresponding to the TRMV genome resulted in systemic symptoms in both hosts. These symptoms were analogous to those observed when using the pure isolates obtained in this study. The combination of pUb1-49 and -62 did not result in systemic infection, indicating that these two components do not form viable pseudo-recombinants. TRMV was sap-transmitted from N. benthamiana leaves to N. benthamiana plants, and by grafting to S. tuberosum and Datura stramonium. Samples from tomato plants showing symptoms similar to golden mosaic were collected in three different municipal districts in the region of Triângulo Mineiro. PCR analysis indicated that 148 out of 170 collected samples were infected with a begomovirus. From these infected samples, only one hybridized at 68°C to a specific probe for the DNA-A of TRMV. However, 109 samples hybridized at 58°C to the same probe. Thirty- nine samples did not hybridize to this probe at either temperature. These results indicated that most of the samples contained geminiviruses genetically related to TRMV. TRMV-A and TRMV-B were detected, respectively, in plants of Nicandra physaloides and Phaseolus vulgaris growing naturally nearby tomato fields. A genetic analysis based on PCR-RFLP from fragments obtained from collected samples demonstrated the existence of a high degree of genetic diversity of begomoviruses in tomato plants cultivated in the region of Triângulo Mineiro.