Defosforilação de caseínas por via enzimática e química

Abstract

No leite, as micelas de caseína encontram-se sob a forma de uma associação de moléculas altamente hidratadas, que são acessíveis às moléculas do solvente. Essa característica permite que as micelas de caseínas sejam passíveis de modificações quando as condições físico-químicas do meio são alteradas ou quando enzimas específicas são adicionadas ao leite. Nesse contexto, o objetivo geral do trabalho foi modificar a estrutura micelar das caseínas por meio da defosforilação por via enzimática (por fosfatases) e química (por acidificação). Inicialmente, foi realizada a defosforilação em suspensões de caseinato de sódio e de cálcio utilizando fosfatase alcalina de bezerro (FAL) (EC 3.1.3.2, Sigma, Saint Louis, USA). Observou-se que ambas as suspensões de caseinato foram defosforiladas por FAL e que a presença de cálcio influenciou negativamente a defosforilação. Após analisar a defosforilação em substratos mais simples, o foco do trabalho passou a ser a modificação das micelas de caseína em leite esterilizado (UHT) desnatado, utilizando FAL e fosfatase ácida de batata (FAC) (EC 3.1.3.1, Sigma, Saint Louis, USA). Entretanto, os perfis cromatográficos (HPLC/PR) e os espectros de massa (ESI/MS) das amostras de caseinato e leite demonstraram que as enzimas FAL e FAC estavam contaminadas por enzimas proteolíticas. Logo, a defosforilação observada em leite UHT desnatado ocorreu devido a duas possibilidades. Uma dessas possibilidades é que as Massas Molares das enzimas FAL e FAC não inviabilizaram seu acesso ao interior das micelas, e o envolvimento dos resíduos de fosfosserina na formação de fosfato de cálcio coloidal não impediu a defosforilação. Contudo, após verificar proteólise em ambas as amostras adicionadas de FAL e FAC, a defosforilação pode também ter ocorrido nos peptídeos fosforilados liberados para fase contínua do leite. Uma vez que tal contaminação inviabilizaria o conhecimento preciso da perda de grupos fosfato nas características das micelas de caseína, modificou-se a forma de defosforilação, que passou a ser de origem química, por acidificação. Para isso, leite cru desnatado foi acidificado a pH 5,5, 6,1 e 6,7 (controle sem acidificação) a fim de solubilizar o fosfato de cálcio coloidal presente no interior das micelas de caseína. Após a acidificação as amostras foram dialisadas contra ultrafiltrado de leite, liofilizadas e ressuspendidas a 10 % (m/m). Como a etapa de acidificação leva à solubilização de outros minerais além do fósforo (Ca, Mg e citrato), a defosforilação por via química pode ser mais precisamente denominada de desmineralização. Os resultados indicam que a desmineralização das micelas de caseína em leite cru desnatado não influenciou características como potencial zeta, tamanho médio, distribuição de tamanho e hidratação micelar. Por outro lado a cor e o percentual de caseínas sedimentáveis diminuíram com o avanço da desmineralização. Esses resultados sugerem que as amostras desmineralizadas apresentavam caseínas como uma mistura de caseinato e micelas de caseína. À medida que a desmineralização foi mais intensa, a proporção de micelas de caseína diminuiu.

In the milk, casein micelles are found in the shape of an association of highly hydrated molecules, which are accessible to the solvent molecules. This characteristic allow the casein micelles to be able to be modified when the physical-chemical conditions in the medium are changed or when the specific enzymes are added to the milk. In this context, the general objective of the study was to modify the casein micelle structure through the dephosphorylation by the enzymatic (with phosphatase) and chemical way (with acidification). At the beginning, the dephosphorylation was made in suspension of sodium and calcium caseinate using calf alkaline phosphatase (FAL) (Sigma 3.1.3.2, Saint Louis, USA). It was noticed that both of the suspension of caseinate was dephosphorilated by FAL and the presence of calcium affected negatively the dephosphorilation. After analyzing the dephosphorylation in more simple substrate, the focus of study start to be the modification of casein micelles in the UHT defatted milk, using the FAL and the potato acid phosphatase (FAC) (Sigma 3.1.3.1, Saint Louis, USA). The chromatographic profiles (HPLC/RP) and spectrum of mass (ESI/MS) of milk and caseinate samples showed that the FAL and FAC were contaminated by proteolytic enzymes. So, the the dephosphorylation observed in UHT defatted milk occurred due two possibilities. One possibility is the casein micelles structure and the involvement of phosphoseryn residues in the bridges of colloidal calcium phosphate didn t prevent the dephosphorylation. However, after to verify proteolysis in both samples with FAL and FAC, the dephosphorylation can be occurred in the peptides relesead in the continuous phase. Such contamination would make hard the knowledge of the phosphate groups lost in the characteristics of casein micelles. As a result the way of dephosphorylation was modified, so it became as a chemical origin, by acidification. For that, raw defatted milk was acidified to pH 5.5, 6.1and 6.7 (control without acidification) to soluble the colloidal calcium phosphate present inside of casein micelles. After the acidification, the samples were dialyzed against the ultrafiltrated of milk, lyophilized and ressuspended at 10% (m/m). As the step of acidification takes to solubilization of others minerals beside the phosphorus (Ca, Mg and citrate), the dephosphorylation by the chemical way can be more precisely called of demineralization. The results indicate that the demineralization of casein micelles in raw defatted milk didn t influence the characteristics as zeta potential, medium size, size distribution and micelar hydration. Nevertheless the values of whiteness and the percent of sedimentable caseins decreased with the advance of the demineralization. Those results suggest that the demineralizated samples shown caseins as a mix of caseinate and casein micelles. As the demineralization was more intense, the proportion of the casein micelles reduced.