Avaliação de protocolos alternativos para enumeração de culturas starter e bactérias láticas utilizadas na produção de salame

Abstract

As principais culturas starter utilizadas para produção de derivados cárneos fermentados são micro-organismos do grupo das bactérias láticas (BAL) e Staphylococcus coagulase negativa. Os gêneros Pediococcus e Lactobacillus possuem como principal característica a acidificação dos produtos e produção de compostos responsáveis pela determinação de aroma e sabor. Staphylococcus coagulase negativa contribuem para o desenvolvimento e a estabilidade da cor vermelha e para o desenvolvimento de outras propriedades sensoriais, como textura e aroma. O monitoramento adequado dessas populações é indispensável para manutenção da qualidade e inocuidade desses produtos. Porém, as metodologias convencionais de enumeração de culturas starter em alimentos possuem limitações quanto a praticidade e seletividade. Com isso, placas PetrifimTM AC tem sido empregadas para enumeração de culturas starter em produtos lácteos fermentados, desde que associadas a meios de cultura com agentes seletivos para grupos microbianos específicos. Considerando a escassez de dados científicos que demonstrem a pertinência de utilização de placas PetrifimTM AC associadas a meios de cultura seletivos para enumeração de BAL em produtos cárneos fermentados, o presente estudo tem como objetivo avaliar o uso de placas PetrfilmTMAC associado ao caldo MRS e vermelho de clorofenol para enumeração de culturas starter adicionadas em salames. Quatorze culturas puras e dois mix de culturas starter foram enumerados em seis protocolos diferentes: 1) PetrifilmTM AC associados ao caldo MRS adicionado de vermelho de clorofenol incubado em aerobiose e 2) em anaerobiose, 3) ágar MRS associado a vermelho de clorofenol, 4) MRS associado a púrpura de bromocresol, 5) MRS pH 5,7, e 6) ágar All Purpose Tween. Em seguida, amostras de salame foram obtidas e suas culturas starter enumeradas pelos protocolos 1, 2, 3 e 5. A análise de variância indicou ausência de diferenças significativas entre os protocolos de enumeração, independente dos tempos de incubação considerados (24, 48 e 72 horas). De maneira geral as contagens de culturas puras e culturas starter não apresentaram diferenças significativas considerando os diferentes tempos de incubação (exceto para AS 308 e S. xylosus em MRS com pH 5.7). Houve correlação significativa entre os protocolos, indicando a equivalência entre as contagens de culturas puras e culturas starter obtidas em aerobiose e em anaerobiose (p < 0,05). Os parâmetros de regressão linear também indicam correlações adequadas entre as contagens obtidas após 24, 48 e 72 h de incubação, indicando a confiabilidade dos resultados obtidos em um menor tempo de análise (24 h). Considerando os resultados obtidos na enumeração de culturas starter em salames, não foram observadas diferenças significativas entre os protocolos, independente dos tempos e condições de incubação e todas as correlações foram significativas (p < 0,05), indicando equivalências entre os protocolos independente das condições (aerobiose ou anaerobiose) e tempos (24, 48, 72h) de incubação. Após análise morfológica e identificação molecular de isolados obtidos das amostras de salame pelos protocolos avaliados, verificou-se uma seletividade adequada dos mesmos, que permitiram a formação de colônias apenas por micro-organismos dos gêneros Lactobacillus e Pediococcus, bem como Staphylococcus coagulase negativa, tipicamente utilizados como culturas starter para a produção de salame. Esses resultados confirmam a viabilidade da utilização de PetrifilmTM AC associado ao caldo MRS e vermelho de clorofenol para enumeração de culturas starter isoladas e em amostras de salame, em diferentes condições de aerobiose e em um reduzido período de incubação, representando vantagens a serem consideradas no monitoramento desses micro- organismos.

The main starter cultures used for the production of fermented meat products are microorganisms from the group of lactic acid bacteria (LAB) and Staphylococcus coagulase negative. Pediococcus and Lactobacillus present as main technological characteristic the acidification of products and production of compounds responsible for determining aroma and flavor. Staphylococcus coagulase negative contributes to the development and stability of the red color and the development of others sensory properties such as flavor and texture. Monitoring the populations is essential for maintaining the quality and safety of these products. However, conventional methods for enumeration of starter cultures in foods have limitations, due to poor selectivity and handling. Thus, PetrifilmTM AC plates have been used for enumeration of starter cultures in fermented dairy products, since associated with culture media with selective agents for specific microbial groups. Considering the lack of scientific data demonstrating the relevance of using PetrifilmTM AC plates associated with selective culture media for LAB enumeration in fermented meat products, the present study aimed to assess alternative protocols for the enumeration of starter culture in salami. Fourteen reference strains and two mix of starter cultures were plated on six different protocols: 1) PetrifilmTM AC added to MRS broth and chlorophenol red incubated in aerobiosis and 2) in anaerobiosis 3) agar MRS added to chlorophenol red 4) MRS added to bromocresol purple 5) MRS pH 5.7 and 6) agar All Purpose Tween. Then, samples of salami were obtained and their starter cultures enumerated by plating using protocols 1, 2, 3 and 5. The analysis of variance showed no significant differences between the enumeration protocols, independent of the incubation time: 24, 48 and 72 h. Generally, the counts of pure cultures of microorganisms and reference starter cultures showed no significant differences considering the different incubation times (except for AS 308 and S. xylosus in MRS at pH 5.7). The results indicated a significant correlation between the protocols, indicating equivalence between the counts of reference cultures and starter cultures in aerobiosis and anaerobiosis (p < 0.5). The linear regression parameters also indicate appropriate correlations between the counts obtained after 24, 48 and 72 h of incubation, indicating a reliability of the results obtained in a shorter analysis time (24 h). Considering the results obtained in the enumeration of starter cultures in salami, no significant differences were observed among the protocols considered, independent of time and incubation conditions, and all correlations were significant (p < 0.05), indicating equivalence between the protocols independent the conditions (aerobiosis and anaerobiosis) and time (24, 48 and 72 h) of incubation. After morphological and molecular identification of isolates obtained from samples of salami by the tested protocols, it was observed an adequate selectivity, which allowed the formation of colonies only by microorganisms of the genera Lactobacillus, Pediococcus and Staphylococcus coagulase negative, typically considered as starter cultures for the salami production. These results confirm the feasibility of using PetrifilmTM AC associated to MRS broth and chlorophenol red for enumeration of isolated starter cultures and starter cultures from salami samples, in different aerobic conditions and in a reduced incubation period, representing advantages to be considered during the monitoring of these microorganisms.