Produção, purificação e identificação de enzimas extracelulares de fungos nematófagos e suas atividades nematicidas

Abstract

O controle biológico é uma das possíveis aplicações biotecnológicas de enzimas fúngicas. Este tipo de controle se destaca por ser uma alternativa “limpa”, sem o uso de produtos químicos que possam gerar possíveis resíduos. Nesse contexto, fungos nematófagos produzem enzimas extracelulares envolvidas em diversas etapas da infecção, como liberação de nutrientes para o crescimento do microrganismo, penetração da cutícula pela degradação proteica e digestão do tecido hospedeiro. O mecanismo molecular da ação patogênica de fungos contra nematoides não é completamente conhecido. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo otimizar a produção, purificar e caracterizar enzimas extracelulares produzidas por fungos nematófagos, bem como avaliar sua capacidade nematicida. Micélios obtidos da transferência de discos de cultura de três isolados de fungos nematófagos (Monacrosporium thaumasium (NF34), M. sinense (SF53) e Pochonia chlamydosporia (VC4)) mantidos em corn-meal-ágar 2% (CMA 2%) e transferidos para frascos contendo meio de cultura que teve sua composição otimizada para a produção de protease e quitinase. Em seguida, as enzimas foram purificadas e caracterizadas em relação ao pH e temperatura. Por fim, foi demonstrada a atividade nematicida dos extratos brutos e das enzimas purificadas sobre larvas de nematoides. Duas varíaveis (pH e tempo de incubação), apresentaram um efeito significativo (p<0,05) sobre a produção de protease do fungo nematófago Monacrosporium sinense (SF53). Além disso, este fungo produziu três diferentes proteases (Ms1, Ms2 e Ms3) com atividade nematicida sobre larvas de Panagrellus redivivus, sugerindo que essas proteases sejam produzidas como um complexo enzimático eficaz na destruição de larvas de primeiro estágio de Angiostrongylus vasorum. Em relação a M. thaumasium (NF34), foi observada atividade nematicida (p<0.01) de seus conídios e de seu extrato bruto proteolítico em coproculturas sobre larvas de primeiro estádio de A. vasorum. Os efeitos das variáveis (quitina, quitina coloidal, glicose, nitrato de sódio (NaNO 3 ), umidade) sobre a produção xiide quitinase em fermentação no estado sólido pelos isolados de Monacrosporium NF34 e SF53 foram analisados usando o planejamento estatístico Plackett-Burman. Para o isolado NF34, nos níveis avaliados, a presença de quitina e NaNO 3 nos meios de cultura foram significativas (p<0,05) para a produção de quitinase. Por outro lado, para o isolado SF53, nos níveis avaliados, apenas a presença de glicose foi significativa (p<0,05) para a produção de quitinase. Em relação a influência do pH na atividade enzimática, para M. thaumasium (NF34), o valor de pH com maior atividade obtida foi 5.5. Entretanto, para M. sinense (SF53), a maior atividade foi observada em pH 8. Além disso, observou-se que o isolado NF34 produziu duas quitinases distintas com a atividade nematicida sobre larvas de P. redivivus. Por fim, a atividade ovicida do fungo nematófago Pochonia chlamydosporia (VC4) e de suas proteases e quitinases foi avaliada sobre ovos de Dioctophyma renale. Houve diferença significativa (p <0,01) na destruição de ovos em relação ao grupo de controle, não se verificando diferença estatisticamente significativa (p> 0,01) entre as concentrações de P. chlamydosporia na destruição de ovos. No entanto, houve uma tendência de aumento da mortalidade com o aumento da concentração de P. chlamydosporia. As proteases e quitinases do isolado VC4, causaram uma redução de percentagem significativa (p <0,01) no número de ovos viáveis de D. renale, em relação ao controle, com os seguintes valores de redução: 27,8% (proteases), 29,4% (quitinases) e 43,4% (proteases + quitinases). Mais estudos devem ser conduzidos no sentido de otimizar as condições de produção de enzima e aplicação destas no combate de nematoides.

Biological control is one of the possible biotechnological applications of fungal enzymes. This type of control is known for being a "clean" alternative, without the use of chemicals that may generate residues. In this context, nematophagous fungi produce extracellular enzymes that are involved in various stages of infection, such as release of nutrients for microorganism growth, cuticle penetration through protein degradation and digestion of host tissue. However, the detailed molecular mechanism of pathogenic action of fungi against nematodes is not complete known. Thus, the present study aimed to optimize production, purify and characterize extracellular enzymes produced by nematophagous fungi and evaluate their nematicidal ability. Mycelia were collected through the transfer of culture dishes of three isolates (Monacrosporium thaumasium (NF34), M. sinense (SF53) and Pochonia chlamydosporia (VC4)) of nematophagous fungi kept in 2% corn-meal-agar (2% CMA) and transferred to vials containing culture medium that had the composition optimized for the production of protease and chitinase. Then, the enzymes were purified and characterized with respect to pH and temperature. Finally, the nematicidal activity of crude extracts and purified enzymes on nematodes larvae was demonstrated. Two variables (pH and incubation time) showed a significant effect (p <0.05) on the production of protease from nematophagous fungus Monacrosporium sinense (SF53). Moreover, this fungi produced three different proteases (Ms1, Ms2 and MS3) with nematicidal activity against Panagrellus redivivus larvae. It is also suggested that these proteases are produced in an enzymatic complex that was effective in the destruction of first-stage larvae of Angiostrongylus vasorum. Regarding M. thaumasium (NF34), it was observed nematicidal activity (p <0.01) of its conidia and crude extract in proteolytic coprocultures on first stage larvae of A. vasorum. The effect of the variables (chitin, colloidal chitin, glucose, sodium nitrate (NaNO 3 ), moisture) on chitinase production in solid state fermentation by Monacrosporium isolates SF53 and NF34 were analyzed using Plackett- xivBurman statistical design. For the isolate NF34, at the evaluated levels, the presence of chitin and NaNO 3 in culture medium was significant (p <0.05) for the production of chitinase. On the other hand, for isolate SF53, at the evaluated levels, only the presence of glucose was significant (p <0.05) for chitinase production. Regarding the influence of pH on enzyme activity, for M. thaumasium (NF34) the pH value with the highest activity was 5.5. However, for M. sinense (SF53), the highest activity was observed at pH 8. Furthermore, it was observed that the isolate NF34 produced two different chitinases with nematicidal activity against larvae of P. redivivus. Finally, the ovicidal activity of the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia (VC4) and its proteases and chitinases was evaluated on Dioctophyma renale eggs. There was a significant difference (p <0.01) in the destruction of eggs in relation to the control group. Moreover, there was no difference (p> 0.01) between the concentrations of P. chlamydosporia in the destruction of eggs. However, there was a trend for increased mortality with increasing its concentration. Proteases and chitinases of isolate VC4 have caused a significant percentage reduction (p <0.01) in the number of viable eggs of D. renale, compared to control, with the following values of reduction: 27.8% (proteases), 29 4% (chitinase) and 43.4% (proteases + chitinases). More studies should be conducted to optimize enzyme production conditions and the application of these on nematodes.