Efeito de diferentes crioprotetores e aditivos no diluente sobre a qualidade seminal de garanhões da raça Mangalarga Marchador

Abstract

Este trabalho foi realizado com o objetivo de comparar os efeitos de diferentes crioprotetores e aditivos na criopreservação do sêmen equino sobre a viabilidade espermática in vitro pós-descongelamento. Para tanto, foram designados dois experimentos (E). No E1 objetivou-se comparar o efeito do glicerol (GLIC) e da dimetilformamida (DMFA), associados ou não, sobre a viabilidade espermática in vitro pós-descongelamento, o que conferiu quatro grupos experimentais: glicerol a 5 % (GLIC), dimetilformamida a 5 % (DMFA), dimetilformamida a 3% associada ao glicerol a 2 % (DG) e o tratamento controle, composto pelo diluente comercial Botu-Crio® (BC). Já no E2 objetivou-se avaliar o efeito do congelamento de sêmen de garanhões em diluente contendo glicerol e/ou dimetilformamida, associados à antocianina (ATC) e/ou colesterol carreado por ciclodextrina (CCC). Para tanto, os ejaculados foram congelados em dez diferentes tratamentos, de acordo com as associações entre crioprotetores e aditivos. As amostras de ambos os experimentos foram avaliadas mediante teste de termo-resistência (TTR) e por meio de citometria de fluxo quanto à integridade de membrana plasmática e acrossomal, potencial mitocondrial, produção de peróxido de hidrogênio intracelular e peroxidação lipídica da membrana plasmática; a avaliação quanto à organização da bicamada lipídica só foi realizada no E1. Os melhores resultados obtidos no TTR do E1 foram referentes aos tratamentos DMFA e DG (p<0,05), que mantiveram as maiores médias de motilidade espermática total após trinta minutos de incubação a 37 oC. O potencial mitocondrial não sofreu alteração frente aos tratamentos aplicados (p>0,05). A maior proporção de células com integridade de membrana plasmática e acrossomal foi observada nos tratamentos DMFA e BC (p<0,05). A análise de organização de membrana revelou maior desorganização no tratamento GLIC (p<0,05). Foi observada maior proporção de células viáveis com alta produção de peróxido de hidrogênio no tratamento DMFA e menor proporção no tratamento GLIC (p<0,05). Quanto à peroxidação da bicamada lipídica, não foram observadas diferenças entre os valores médios nos tratamentos (p>0,05). Em relação ao E2, não houveram interações entre crioprotetores e diluentes para maioria das características estudadas, sendo as comparações realizadas entre grupos de tratamentos. Entre os crioprotetores, o grupo DMFA apresentou os melhores resultados quanto à motilidade espermática durante o TTR, seguido do grupo DG (p<0,05) e dentre os aditivos os grupos CCC e AC foram superiores aos demais (p<0,05). Em relação à integridade de membrana plasmática e acrossomal, os grupos BC e GLIC apresentaram os piores resultados dentre os crioprotetores, assim como os grupos BC e ATC dentre os aditivos (p<0,05). As maiores médias obtidas quanto ao potencial mitocondrial foram referentes aos grupos DMFA e DG entre os crioprotetores, e CCC e AC entre os aditivos (p<0,05). Foi observada maior proporção de células viáveis com alta produção de peróxido de hidrogênio nos grupos DMFA e DG dentre os crioprotetores, e nos grupos CCC e AC dentre os aditivos (p<0,05). Em relação à peroxidação da membrana plasmática foi observada interação entre crioprotetores e aditivos na população de células viáveis (p<0,05), de forma a revelar melhor associação da CCC à DMFA. Diante dos resultados obtidos, concluiu-se que os tratamentos DMFA e DG apresentaram melhores condições para manutenção da viabilidade espermática in vitro, de forma que ambos podem sem utilizados como alternativa em diluidores na criopreservação de sêmen equino. Em relação ao uso da CCC, a sua associação deve ser feita preferencialmente com a DMFA. Os resultados obtidos quanto à ação da ATC não foram satisfatórios, necessitando de novos estudos quanto à concentração ideal e seus efeitos no congelamento de sêmen de garanhões.

The aim of this study was to compare the effects of different cryoprotectants and additives in cryopreservation of Mangalarga Marchador stallions semen on sperm viability in vitro post-thaw. Thus, we designed two experiments (E). In E1 we aimed to compare the effect of glycerol and dimethylformamide, associated or not, on the sperm viability post-thawing. Therefore we collected thirty ejaculates from four stallions. Each one was divided into four treatments: 5% glycerol (GLYC), 5% dimethylformamide (DMFA), an association of 2% glycerol and 3% dimethylformamide (DG) and control treatment compound by Botu-Crio®. In E2 we aimed to evaluate the effect of stallions semen freezing in diluent containing glycerol and or dimethylformamide associated with the anthocyanin (ATC) and or cholesterol loaded cyclodextrin (CCC). We collected orty-eight ejaculates of eight stallions and each one was frozen in ten different treatments, according to the associations between cryoprotectants and additives. The samples of both experiments were evaluated by thermo- resistance test (TTR) and by flow cytometry as to integrity of plasma and acrosomal membrane, mitochondrial potential, intracellular peroxide hydrogen production, lipid peroxidation and organization of the plasma membrane bilayer (only E1). The E1 best results on the TTR were related to DMFA and DG treatments (p<0.05), who maintained the highest average total sperm motility after thirty minutes of incubation at 37 ° C. Mitochondrial potential was not affected by any group (p>0.05). The highest proportion of cells with plasma and acrosomal membrane integrity was observed in DMFA and BC treatments (p<0.05). The analysis revealed the organization of membrane disruption was greater in GLIC treatment (p<0.05). We observed a higher proportion of cells with high production of hydrogen peroxide in the treatment DMFA and a lower proportion in GLIC treatment (p<0.05). As for the peroxidation of the lipid bilayer, no differences were observed between treatments (p>0.05). About E2 there were no interactions between cryoprotectants and diluents for most traits, with comparisons made between treatment groups. Among the cryoprotectants, DMFA group showed the best results on the TTR, followed by DG group (p <0.05) and among the additives CCC and AC groups were superior to the others (p <0.05). Regarding the integrity of plasma and acrosomal membrane, the BC and GLYC groups showed the worst results among cryoprotectants, as well as BC and ATC groups among the additives (p <0.05). The highest mean about mitochondrial potential were related to DMFA and DG groups among cryoprotectants, and CCC and AC between additives (p <0.05). There was a higher proportion of cells with high production of hydrogen peroxide in DMFA and DG groups from the cryoprotectants, and CCC and AC groups among the additives (p <0.05). In relation to the plasma membrane peroxidation was observed interaction between cryoprotectants and additives in the population of viable cells (p <0.05), in order to better reveal the association CCC plus DMFA. It was concluded that the DMFA and DG treatments showed better conditions for maintaining sperm viability in vitro, so both can use like alternative method for cryopreservation of stallion semen. The association with the CCC should be made preferably by with DMFA. The results related to ATC were not satisfactory, revealing with it the need for new studies about its optimal concentration and effects on semen freezing stallions.