Produção in vitro de embriões caprinos pré-púberes: efeito da melatonina nos meios de maturação in vitro e cultivo in vitro embrionário

Abstract

A produção in vitro de embriões caprinos ainda não é considerada uma biotecnologia rotineiramente efetiva. Um dos fatores mais importante e que dificulta a evolução no processo de todo o processo da PIV é o estresse oxidativo. A proposta adotada neste estudo foi avaliar os efeitos da adição de melatonina em meios de maturação e cultivo in vitro no desenvolvimento de embriões caprinos e na qualidade dos blastocistos oriundos de oocitos de cabras pré-púberes. O objetivo do primeiro estudo foi avaliar o efeito da melatonina no meio de cultura in vitro de embriões partenogenéticos através da taxa de desenvolvimento de blastocistos e vitrificação. Foi utilizado um meio de maturação e de cultivo in vitro e convencional com e sem melatonina (10-9 mol L-1). Os oocitos com células do Cumulus oophorus foram maturados in vitro naqueles meios de maturação por 27 h e então ativados. Estas células ativadas foram cultivadas nos respectivos meios de cultivo por oito dias e então aferidos as taxas de blastocistos. O método de vitrificação foi utilizado de acordo com Mermillod et al., 1998. A adição da melatonina a 10-9 mol L- aos meios de maturação e de cultivo in vitro não apresentou melhora na taxa de blastocistos produzidos. Na segunda parte deste estudo objetivou-se avaliar o efeito da melatonina no meio de cultura in vitro, porém em embriões fertilizados artificialmente, por meio da taxa de desenvolvimento de blastocistos. Utilizou-se um meio convencional para MIV com ou sem adição de melatonina a 10-9 mol L-1. Após a MIV, os oocitos maturados foram inseminados com semen a fresco, e os espermatozoides foram capacitados em meio de capacitação contendo heparina. Os possíveis zigotos foram separados e uma parte foi cultivado em meio de cultura padrão com adição da melatonina a 10-9 mol L-1. Ambos foram cultivados durante oito dias e a taxa de blastocisto foi aferida. Os resultados desta segunda etapa mostraram que ao utilizar melatonina a 10-9 mol L-1 adicionada ao meio de maturação in vitro convencional melhoraram quanto ao número de células fertilizadas (34,57% vs. 17,39%, p<0,05), embora, não houve melhora na taxa de clivagem e no número de blastocistos produzidos. A conclusão mostra que a melatonina a 10-9 mol L-1 adicionada tanto em MIV, quanto em CIV, não melhora o desenvolvimento e a produção dos embriões in vitro, embora possa aumentar a taxa fertilização in vitro.

The in vitro production of goat embryos is not considered a routinely effective biotechnology. There are a number of factors that hinder the progress in the process of maturation, fertilization, cultivation and freezing. One of the most important factors that cause deleterious effects throughout the IVP process is the oxidative stress. The proposal of this study in order to prevent and to control that stress condition was to supplement the in vitro maturation (IVM) and in vitro culture media (IVC) with melatonin evaluating it effects on the development of goat embryos and quality of embryos derived from prepubertal goats oocytes. The aim of the first experiment was to evaluate the effect of melatonin supplementation in the in vitro culture on development of parthenogenetic embryos. It was used two in vitro maturation media [conventional maturation media (CM) and CM + 10-9 M melatonin] and two in vitro culture media [conventional cultivation media (CC) and CC + 10-9 M melatonin. The oocytes with cumulus cells were randomly distributed in the IVM and then activated by ionomycin method followed by 6-DMAP. Afterwards, presumptive zygotes were randomly distributed in the IVC media and cultured for eight days. Supplementation of 10-9 M melatonin to the IVM and IVC media showed no improvement in the parthenogenetic blastocyst rate. The blastocyst rate diminished when melatonin was added in vitro culture medium. The second study was also evaluate the effect of melatonin in vitro culture medium, but using in vitro fertilization over the blastocyst development rate. We used a conventional medium (CM) to in vitro maturation media and other CM was supplemented with melatonin at 10-9 M. After IVM, the matured oocytes were inseminated with fresh semen, and then, that spermatozoa were capacitated and cultured for eight days. There was an in vitro culture media used and other one added with melatonin (10-9 M). The results of this second study demonstrated that the use of melatonin at 10-9 M added to the in vitro conventional maturation medium presented a beneficial effect on the number of fertilized cells (34.57 % vs. 17.39%, p<0.05). However, this addition there was no improvement in the cleavage rate nor the blastocyst rate. We concluded that melatonin at 10-9 M added in both IVM medium and IVC medium do not improve the development of embryos. However, it can be a gain in the in vitro fertilization rate when melatonin is added in the IVM medium.