Criopreservação de sêmen de garanhões da raça MangalargaMarchador em diluidores com diferentes meios crioprotetores associados ou não à antocianina

Abstract

O presente estudo teve como objetivo a avaliação comparativa dos crioprotetores glicerol, etilenoglicol e dimetilformamida, além da adição de antocianina ao meio base de congelamento, como tentativa de minimizar os danos celulares oriundos do processo de criopreservação. Foram utilizados seis garanhões da raça Mangalarga Marchador, maturos sexualmente, hígidos e aprovados para reprodução por meio de exame andrológico. As coletas de sêmen foram realizadas com intervalos de dois dias pelo método da vagina artificial com auxílio de uma fêmea em estro natural ou induzido ou manequim, totalizando cinco ejaculados por garanhão. A primeira etapa do estudo teve por finalidade determinar a melhor concentração destes crioprotetores e aditivo para que fosse usada na etapa seguinte. Para este fim foram realizadas análises de motilidade espermática progressiva total e vigor espermático. Verificou-se que as concentrações de 4, 5 e 6 % de etilenoglicol e dimetilformamida utilizadas isoladamente nos diluentes de criopreservação não tiveram diferença (P>0,05) sobre os parâmetros de motilidade espermática progressiva total e vigor espermático. Os mesmos crioprotetores utilizados em associação podem ser feitos nas proporções 1:4 e 2:3 % (etilenoglicol : dimetilformamida) sem proporcionar diferenças nos parâmetros físicos do sêmen espermatozoides. Na segunda etapa, as amostras de sêmen criopreservadasforam submetidas às análises físicas convencionais (motilidade espermática progressiva total e vigor espermático), teste de termo- resistência e a análise do grau de integridade das células espermáticas utilizando sondas fluorescentes e analisados por meio da citometria de fluxo. Os tratamentos experimentais foram assim constituídos: Controle Botucrio (B); Etilenoglicol 4% (E); Dimetilformamida 5% (D); Etilenoglicol + Dimetilformamida (ED) ou associados com antocianina (BA, EA, DA e EDA) na verificou-se os piores valores médios em todos os testes, enquanto nos tratamentos D e DA se mostraram menos agressivos às membranas plasmática e acrossomal. Os valores médios de motilidade espermática progressiva total e vigor espermático foram semelhantes em todos os tratamentos, exceto nos tratamentos E e EA, que foram inferiores. No entanto, os tratamentos empregando o diluente a base de dimetilformamida caíram aproximadamente 50 % nos valores de motilidade espermática nos primeiros 30 minutos do teste de termorresistência quando comparados ao tratamento controle (B) ou acrescido de antioxidante (BA). Resultado condizente com os valores percentuais de células com o potencial de membrana mitocondrial íntegro quantificados por meio de citometria de fluxo. A antocianina parece ter efeito neutralizador de radicais livres produzidos por células inviáveis, podendo ser utilizada como antioxidante não penetrante na criopreservação do sêmen de equinos da raça Mangalarga Marchador.

The present study aimed at comparative assessment of glycerol, ethyleneglycol and dimethylformamide as cryoprotectants, and the addition of an anthocyanin in the extander base of freezing, as an attempt to minimize cell damage arising from the cryopreservation process. Six stallions MangalargaMarchador breed, sexually mature, healthy and approved for breeding by breeding soundness evaluationwere used. Semen was collected in intervals of two days by artificial vagina method with the aid of a female in natural or induced estrus or manikin, totalizing five ejaculates per stallion.Thefirst stage of the study aimed to determine the best concentration of these cryoprotectants and additive to be used onthe following stage. For this purpose were conducted analysis of spermaticprogressive motilityand spermatic vigor. As results the concentrations of 4, 5 and 6% ethyleneglycol and dimethylformamide used alone had no differences ( P>0.05 ) on the spermatic progressive motilityand spermatic vigor. The same cryoprotectants can be used in association in the proportions 1:4and 2:3% (ethyleneglycol: dimethylformamide) without differences in the physical parameters of criopreservaited semen. The anthocyanin may be used in concentrations of 0.5 and 3 μL / 100 million of espermatozoa, but not on the concentration of 9 μL / 100 million of espermatozoa. At the second stage, the semen criopreservated samples were subjected to conventional physical analysis (total spermatic motility and spermatic vigor), thermal resistance test, and analysis of the level of integrity of sperm cells using fluorescent probes by flow cytometery. The treatments were constituted as follows: Control Botucrio (B); 4 % Ethyleneglycol (E); Dimethylformamide 5 % (D); Ethyleneglycol + Dimethylformamide (ED) orassociated with anthocyanin (BA, EA, DA, and EDA) at 0.5 μL / 100 million spermatozoaconcentration. For E and EA treatments, there were verified the worst average valuesfor all tests, meanwhile D and DA treatments showed to be less aggressive to the plasma and acrosome membranes. The mean values of spermatic progressive motility and spermatic vigorwere similar for all treatments, except for the treatments E and EA, witch presented inferior results. Even though, diluents Dimethylformamide-based treatments droppedalmost 50 % in the spermatic motility values at the first 30 minutes of the thermal resistance test compared to control treatment (B) or with anthocyaninadded (BA). This result was consistent with the percentual values of cells with intact mitochondrial membrane potential quantified by flow cytometery. Anthocyanin seems to have a scavenger effect over free radicals produced by unviable cells and can be used as non-penetrating antioxidant for cryopreservation in equine semen of MangalargaMarchadorbreed stallions.