Caracterização funcional da proteína BiP de soja induzida por estresse osmótico e déficit hídrico

Abstract

O chaperone molecular residente do retículo endoplasmático (RE), denominado BiP “Binding Protein”, é membro da classe Hsp70 de proteína de estresse, sendo regulado em resposta a condições de estresse do RE, como acúmulo de proteínas desdobradas e desequilíbrio na homeostase de cálcio. Em condições normais, BiP de mamíferos sofre fosforilação e oligomerização. As modificações de BiP de mamíferos são restritas à forma oligomérica, sendo que a forma monomérica inalterada representa a espécie ativa. Recentemente, foi demonstrado que BiP de soja existe como formas fosforiladas e desfosforiladas interconversíveis, e o equilíbrio pode ser deslocado em qualquer direção em respostas a diferentes estímulos. Em contraste com o tratamento com tunicamicina, o estresse osmótico estimula a fosforilação das espécies de BiP em cultura de células de soja. Nesta investigação foi demonstrado que, independentemente do seu estado de oligomerização, as isoformas de BiP de folhas, sob déficit hídrico, exibem atividade de ligação a proteínas, indicando que a regulação de BiP de plantas pode diferir de outros eucariotos. Foi também caracterizado o estado de oligomerização das isoformas de BiP de soja induzidas por estresse osmótico e tunicamicina. Assim como em células de mamíferos, tanto a forma oligomérica como a monomérica foram detectadas em células de soja não-estressadas. A desfosforilação de BiP mediada por tunicamicina é acompanhada pela conversão da forma oligomérica para a monomérica. Entretanto, a forma fosforilada de BiP induzida por estresse osmótico existe predominantemente como espécie monomérica. Esses resultados indicam que a fosforilação de BiP induzida por estresse osmótico não media a oligomerização da proteína, e pode ter uma função regulatória distinta. A função protetora de BiP em planta foi examinada em condições de estresse hídrico. Plantas transgênicas de Nicotiana tabacum expressando constitutivamente níveis elevados de BiP ou seu cDNA anti-senso foram sujeitas à condição de déficit hídrico progressivo. Elevados níveis de BiP nas linhagens senso conferiram tolerância ao déficit hídrico durante o crescimento das plantas. Sob seca progressiva, os níveis de BiP foliar correlacionaram com a manutenção da turgescência celular e com o conteúdo de água da parte aérea. O efeito protetor da superexpressão de BiP contra estresse hídrico foi anulado pela repressão anti-senso. Embora a superexpressão de BiP previna a desidratação celular, a condutância estomática e a taxa transpiratória em folhas senso estressadas foram superiores em relação às folhas controles e anti-senso. Em plantas anti-senso, a indução do sistema de defesa antioxidativo foi maior do que nas plantas controle, enquanto que em folhas senso estressadas a indução da atividade da superóxido dismutase não foi observada. Coletivamente, esses resultados evidenciam que a superexpressão de BiP em plantas pode conferir tolerância à seca, prevenindo o estresse oxidativo endógeno.

The endoplasmic reticulum molecular chaperone BiP is a member of the Hsp70 family of stress-related protein, that is up-regulated in response to ER-stress condition, such as accumulation of unfolded protein and disruption of the cellular Ca 2+ homeostasis. The mammalian BiP undergoes phosphorylation and oligomerization under normal conditions. Modification of mammalian BiP is restricted to the oligomeric form and the monomeric unmodified form represents the active species. In fact, the glycosylation inhibitor tunicamycin induces dephosphorylation of mammalian BiP, which is accompanied by conversion of the oligomeric BiP pool to the monomeric form. Recently, we have shown that the soybean BiP exists in interconvertible phosphorylated and unphosphorylated forms and the equilibrium can be shifted to either direction in response to different stimuli. In contrast to tunicamycin treatment, osmotic stress stimulates phosphorylation of BiP species in soybean cultured cells. Here we demonstrated that despite their phosphorylation state, the BiP isoforms from water-stressed leaves exhibited protein-binding activity, suggesting that plant BiP functional regulation may differ from other eukaryotic BiPs. We have further characterized modifications of the tunicamycin and osmotic stress-induced soybean BiP forms. Like in mammalian cells, both monomeric and oligomeric soybean BiP species were detected in untreated soybean cells. Tunicamycin-mediated dephosphorylation of BiP is accompanied by the conversion of the oligomeric form to its monomeric form. Likewise, the hyperphosphorylated osmotic stress-induced soybean BiP exists predominantly as monomeric species. These results suggest that osmotic stress- induced phosphorylation of soybean BiP does not mediate oligomerization of the protein and may serve as a distinct regulatory function. We have also examined the protective function of BiP against water stress at the whole plant level. Transgenic Nicotiana tabacum plants constitutively expresssing elevated levels of BiP or its antisense cDNA were subjected to progressive drought. Elevated levels of BiP in transgenic sense lines conferred tolerance to water deficit during plant growth. Under progressive drought, the leaf BiP levels correlated with the maintenance of the shoot cellular turgor and water content. The protective effect of BiP overexpression against water stress was disrupted by expression of an antisense BiP cDNA construct. Although overexpression of BiP prevented cellular dehydration, the stomatal conductance and transpiration rate in droughted sense leaves were higher than in control and antisense leaves. In antisense plants, the water-stress stimulation of the antioxidative defeses was higher than in control plants, whereas in droughted sense leaves an induction of superoxide dismutase activity was not observed. Collectively, these results demonstrate that overexpression of BiP in plants may confer tolerance to drought by preventing endogenous oxidative stress.