Identificação de genes diferencialmente expressos na interação tomateiro - Alternaria solani

Abstract

A pinta preta, causada pelo fungo Alternaria solani Sor. é considerada uma das mais importantes doenças da cultura do tomateiro provocando perdas que podem chegar a 80%. O desenvolvimento de cultivares resistentes a esta doença é dificultado pela natureza poligênica da resistência e ausência de fontes com altos níveis de resistência. Com o objetivo de identificar genes envolvidos na resposta de defesa do tomateiro à A. solani, foram construídas duas bibliotecas de cDNA a partir de mRNA isolado de folhas da linhagem NC EBR-2 coletadas 24 e 36 horas após a inoculação (hai), utilizando-se a técnica de hibridização subtrativa por supressão (SSH). Análise de 1303 ESTs revelou que 31% apresentam similaridade a genes relacionados com defesa da planta, regulação da expressão gênica e transdução de sinais. Entre os possíveis genes relacionados com a defesa, houve um predomínio de ESTs com similaridade a genes cuja resposta é regulada pelo etileno e ácido jasmônico, e em menor freqüência ESTs com similaridade a genes regulados pelo ácido salicílico. A análise de expressão gênica de 40 genes candidatos por PCR em tempo real (RT-qPCR) revelou que 16 deles (40%) são induzidos em resposta a A. solani. A indução da maioria desses genes tem início entre 6 e 12 hai atingindo uma máxima expressão entre 24 e 36 hai. Devido à resistência a pinta preta estar relacionada à idade fisiológica dos tecidos, comparou-se o nível de expressão dos genes induzidos em resposta ao fungo no dossel inferior (1a e 2a folhas) e superior (4a e 5afolhas) de plantas aos 45 dias após a semeadura. Verificou-se que os genes que codificam proteínas com similaridade a PR-1 básica P1-p14, β-1,3-endoglucanase básica, NtEIG-A1 (Nicotiana tabacum proteína A1), THT1-3 (hidroxicinamoil-CoA tiramina N- hidroxicinamoil transferase), POTLX-3 (lipoxigenase-3) e pSTH-2 (proteína PR STH-2) apresentaram maior nível de expressão no dossel superior onde se observa uma menor severidade da doença. Verificou-se ainda, que alguns desses genes como NtEIG-A1, apresentam também uma maior velocidade de resposta no dossel superior. O maior nível de expressão dos genes de defesa associado a uma maior velocidade de resposta, pode ser um dos fatores responsáveis pela menor severidade da pinta preta observada no dossel superior das plantas de tomateiro.

The tomato early blight, caused by the fungus Alternaria solani Sor., is considered one of the most important diseases of this crop causing yield losses that can reach about 80%. The development of resistant cultivars has been difficult because the resistance is polygenic and germoplasm with adequate levels of resistance to the pathogen is not available. In order to identify genes involved with tomato defense responses against A. solani, two cDNA libraries were constructed from mRNA isolated from leaf samples of the lineage NC EBR2 collected at 24 and 36 hours after inoculation (hai) by using the suppressive subtractive hybridization (SSH) technique. Sequence analysis of 1303 ESTs revealed that 31% of them showed similarities with plant defense genes, regulation of gene expression and transduction signals. Among the putative genes related with defense mechanisms, there was predominance of genes regulated by ethylene and jasmonic acid and a lower frequency of ESTs with similarities to genes regulated by salicylic acid. Real time PCR analysis (RT-qPCR) of 40 genes showed that 16 of them (40%) were induced in response to fungus infection. The induction of the majority of these genes began between 6 and 12 hai, reaching a maximum between 24 and 36 hai. Considering that host resistance to early blight is associated with tissue age, the level of gene expression in older (1st and 2nd) and younger (4th and 5th) leaves were compared from 45 days old plants. Genes coding for PR-1 basic p1-p14, basic β-1,3-endoglucanase, NtEIG-A1 (Nicotiana tabacum protein A1), THT1-3 (N-hydroxycinnamoyl-CoA tyramine N-hydroxycinnamoyl transferase) , POTLX- 3 (Lipoxygenase-3) and pSTH-2 (PR STH2 protein) had a higher level of expression in younger leaves. Moreover, it was observed that genes like NtEIG- A1 had a faster response in younger leaves. High level of defense genes expression associated with a faster response can be one of the mechanisms responsible for the reduced level of disease severity in the younger tomato leaves.