Diversidade genética de Xanthomonas campestris pv. campestris no Brasil

Abstract

Isolados brasileiros e estrangeiros de Xanthomonas campestris pv. campestris, bem como um isolado estrangeiro de X. campestris pv. armoraciae foram estudados quanto à sua variabilidade fenotípica e genotípica por meio de análises metabólicas (BiologTM), análise de ácidos graxos (FAME), eletroforese de campo pulsado (PFGE) e inoculação em série diferenciadora. Os resultados mostram que a identificação de uma mesma fitobactéria pode variar dependendo da técnica aplicada, pois 58% dos isolados estudados receberam identificação conflitante quando os resultados do Biolog e da análise de ácidos graxos foram comparados. No sistema Biolog, em cujo banco de dados não consta a presença de X. campestris pv. armoraciae, os isolados foram identificados como X. campestris pv. campestris (70%), X. campestris pv. raphani (19%), X. axonopodis pv. malvacearum (5,5%) e X. axonopodis pv. phaseoli (5,5%). Na análise de ácidos graxos, os isolados foram identificados como X. campestris pv. raphani (46%), X. campestris pv. campestris (30%), X. campestris pv. armoraciae (11%), X. campestris pv. zinniae (11%) e Stenotrophomonas maltophilia (2%). Para estas duas técnicas, os resultados tiveram, em geral, maior precisão quanto menor a especificidade do nível de classificação (gênero, espécie e patovar). Portanto, uma ou ambas as técnicas não devem ser utilizadas isoladamente e sim como ferramentas auxiliares para confirmação da identidade de uma fitobactéria e sempre associadas à inoculação em gama de hospedeiros, especialmente quando a identificação for ao nível de patovar. Uma subdivisão nos bancos de dados desses sistemas, por exemplo, para espécie hospedeira de onde o material foi isolado, poderia reduzir as chances de uma identificação equivocada. Como os patovares campestris, raphani e armoraciae são capazes de infectar brássicas, recomenda-se também que seja feito um estudo abrangente envolvendo plantas da família Brassicaceae e os patovares de X. campestris capazes de infectá-las, visando estabelecer uma classificação mais consistente. Quando submetidos ao sistema Biolog, todos os isolados utilizaram 14 fontes de carbono. A asparagina não foi utilizada por nenhum isolado e a sacarose não foi utilizada por alguns. Seis grupos foram formados por meio da análise de ácidos graxos. A variabilidade genética dos isolados foi observada na eletroforese de campo pulsado pela formação de 11 (enzima XbaI) e 12 (enzima SpeI) padrões diferentes de bandas nos géis, para isolados brasileiros, e sete padrões para isolados estrangeiros, independente da enzima de restrição utilizada. Foi possível fazer associação entre alguns grupos formados pela análise de ácidos graxos e perfis observados na eletroforese de campo pulsado. Nos experimentos em casa-devegetação, o grande número de plantas resultou em espaçamento insuficiente, o que, provavelmente, contribuiu para uma mistura de isolados, gerando inconsistência nos resultados. Mesmo assim, verificou-se que houve variação de virulência entre os isolados inoculados nas plantas da série diferenciadora e sintomas atípicos, como queima de folhas, foram observados. Estes podem, futuramente, servir de indício para a classificação de um novo patovar de X. campestris. Seria interessante o desenvolvimento de uma série diferenciadora somente com plantas de Brassica oleracea. Resposta semelhante à reação de hipersensibilidade vascular foi observada em alguns casos e deve ser melhor estudada visando a sua aplicação na epidemiologia da podridão negra e nos processos de melhoramento para resistência à X. campestris pv. campestris.

Brazilian and foreign isolates of Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), as well as a foreign strain of X. campestris pv. armoraciae were studied regarding their phenotipic and genotipic variability by metabolic analysis (BiologTM), fatty acids methyl ester (FAME), pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and inoculation in differential series. Results showed that identification of a same strain may vary depending on which system is used as 58% of all strains tested were identified differently by comparing Biolog and FAME results. Xanthomonas campestris pv. armoraciae is not present in Biolog database and the isolates were identified as X. campestris pv. campestris (70%), X. campestris pv. raphani (19%), X. axonopodis pv. malvacearum (5,5%) and X. axonopodis pv. phaseoli (5,5%). FAME identified the isolates as X. campestris pv. raphani (46%), X. campestris pv. campestris (30%), X. campestris pv. armoraciae (11%), X. campestris pv. zinniae (11%) and Stenotrophomonas maltophilia (2%). Both techniques delivered preciser results when identification of a less specificity level was recquired (from gender to patovar). One or both tecquinies can be used as auxiliary systems to identify plant pathogenic bacteria, but should be combined with host range tests, specially if the identification is being made to patovar level. In order to reduce erros, the systems databases could be divided, e.g. according to host. As patovars campestris, raphani and armoraciae are able to infect brassica plants, a broad study of brassica plants and corresponding X. campestris patovars should be made in order to stablish a more consistent classification. All strains used 14 carbon sources in Biolog. Asparagine was not used by any strain while sacarose was not used by some. Strain made six different groups by FAME. Genetic variability of brazilian strains was observed in PFGE with 11 different band patterns formed when restriction enzyme XbaI was used and 12 band patterns when SpeI was used. Foreign strains formed seven band patterns no matter which enzyme was used. A comparative association was made between some of FAME and PFGE groups. Insuficient space on the banchs due to an exceedingly number of plants, which may have cause cross contamination, was probably one of the causes of inconsistent results from greenhouse experiments. Despite that, it was observed virulence variation among the strains when inoculated in plants from the differential series and atypical symptoms were observed, e.g. blight, which could be an evidence of a different X. campestris patovar. A differential series made only with Brassica oleracea species would be interesting. It was also observed a reaction similar to Vascular Hypersensitive Response, which might be an interesting subject to epidemiolgy of black rot and breeding for resistance to Xcc.