Inhibitory substances produced by Lactococcus lactis strains isolated from naturally fermented sausage

Abstract

Neste trabalho, as bacteriocinas produzidas por culturas de Lactococcus lactis isoladas de salame fermentado naturalmente no Brasil foram purificadas e identificadas. O sequenciamento dos produtos amplificados por PCR comfirmou que os genes estruturais das bacteriocinas em todas as culturas de L. lactis são idênticos ao do lantibiótico nisin Z. Plasmídeos foram detectados em todas as culturas de L. lactis e foi observado que culturas curadas foram capazes de produzir bacteriocinas, indicando que os genes relacionados à produção da bacteriocina estão localizados no cromossomo. As bacteriocinas foram purificadas utilizando precipitação das proteínas com sulfato de amônio, cromatografias de troca iônica e de fase reversa, e suas massas moleculares foram confirmadas por MALDI-TOF-TOF. A produção da bacteriocina foi investigada sob diferentes condições de crescimento. Em todas as culturas, a produção de bacteriocina foi paralela ao crescimento celular e alcançou atividade máxima na fase estacionária. Todas as culturas apresentaram produção máxima de bacteriocinas em valores de pH 6.0 e 6.5, em condições de aerobiose e em temperaturas de 25 °C e 30 °C, em meio LAPTg. Triptona e peptona de caseína foram as melhores fontes de nitrogênio para produção das bacteriocinas em todas as culturas. A fonte de carbono foi um dos principais fatores que influenciou a produção de nisin Z. Sacarose foi a fonte de carbono mais eficiente na produção de bacteriocinas pelas culturas de L. lactis ID1.5, ID8.5, PR3.1 e PD4.7, enquanto a frutose foi a fonte de carbono mais eficiente para L. lactis ID3.1. As culturas apresentaram valores de atividades de bacteriocina diferentes, sendo as máximas atividades observadas nas culturas de L. lactis ID1.5 e ID8.5. As sequências dos promotores nisZ e nisF obtidas de todas as culturas foram idênticas entre si, contudo outros fatores podem estar envolvidos nas diferenças da produção das bacteriocinas entre as culturas. Além disso, dois compostos antimicrobianos, de baixo peso molecular, produzidos por L. lactis ID1.5, denominados neste estudo AI e AII, foram purificados e parcialmente caracterizados. O composto AI apresentou um espectro antimicrobiano principalmente contra culturas de L. lactis, incluindo a própria cultura produtora. L. lactis LMGT 2122, Bacillus subtilis DSMZ 347, Listeria innocua BL86/26B, Streptococcus pneumoniae TIGR 4 e Pseudomonas aeruginosa foram os micro-organismos mais sensíveis ao composto AII. A atividade antimicrobiana de ambos compostos foi drasticamente reduzida após tratamento com tween 80, mas a atividade foi mantida após o tratamento térmico e com proteases. Os compostos AI e AII apresentaram propriedades distintas de outras substâncias antimicrobianas produzidas por L. lactis e relevante efeito inibitório contra patógenos do sistema respiratório.