Expressão heteróloga do domínio III da proteína de envolope (E) do vírus dengue-1 e 2 em Pichia pastoris

Abstract

Anualmente os vírus dengue (DENV) são responsáveis por 100 milhões de infecções em todo o mundo. O vírus apresenta quatro sorotipos diferentes, DENV-1, 2, 3 e 4, e é constituído por três proteínas estruturais (C, prM e E) e sete nãoestruturais. A proteína de envelope (E) é responsável pela ligação do vírus à célula hospedeira, sendo composta por três domínios (I, II e III), onde destaca-se o domínio III (DIII) por apresentar conformação “imunoglobulina-like”, sendo considerado o componente mais imunoestimulador. O diagnóstico definitivo da infecção pelos vírus dengue pode ser feito somente no laboratório e depende do isolamento desses vírus, detecção de antígenos virais ou RNA em soro ou tecidos, ou detecção de anticorpos específicos no soro dos pacientes. Esse processo é demorado, o que dificulta a intervenção clínica e epidemiológica. Os kits de diagnóstico rápido e barato resolveriam esta questão, porém o maior entrave para a sua produção tem sido a obtenção de proteínas com função imunoestimulatória em quantidade e qualidade. Neste trabalho, usamos um sistema de expressão heteróloga para a produção do domínio III da proteína de envelope (E) do vírus dengue-1 e 2 como antígeno recombinante. . A levedura Pichia pastoris foi adotada para a expressão deste domínio proteico por apresentar um padrão de modificações pós-traducionais semelhante a de mamíferos. Em nossos resultados, testes moleculares confirmaram a integração do gene do DIII da proteína E ao genoma da levedura. Os testes preliminares quanto a expressão mostraram resultados animadores evidenciando que a expressão heteróloga em Pichia pastoris é promissora quanto a produção de antígenos de interesse biotecnológico.

Annually, the dengue virus (DENV) are responsible for 100 million infections worldwide. The virus has four distinct serotypes, DENV-1, 2, 3 and 4, and consists of three structural proteins (C, prM and E) and seven non-structural. The envelope protein (E) is responsible for binding the virus to the host cell, consisting of three domains (I, II and III), where stands the domain III (DIII) because it presents "immunoglobulin-like" conformation, and it is considered the most immunostimulatory component. The definitive diagnosis of infection by dengue virus can only be done in the laboratory and depends of the isolation of these viruses, detection of viral antigens or RNA in serum or tissue, or detection of specific antibodies in the serum of patients. This process is time consuming, which hinders the epidemiological and clinical intervention. The rapid and cheap diagnostic kits is the solution for this, but the biggest obstacle to its production has been getting immunostimulating proteins in quantity and quality. In this work, we used a heterologous expression system for the production of domain III of envelope protein (E) of dengue virus 1 and 2. The yeast Pichia pastoris has been adopted for the expression of this protein domain because it presenting a pattern of post-translational modifications similar to that of mammals. In our results, molecular tests confirmed the integration of the DIII protein gene in the yeast genome. Preliminary tests about the expression presented encouraging results, it showing that the heterologous expression in Pichia pastoris is promising as the production of antigens of biotechnological interest.