Detecção e isolamento de peptídeos antimicrobianos de folhas de Capsicum annum L. (pimentão Magali R )

Abstract

Peptídeos antimicrobianos (AMPs) têm atraído a atenção de pesquisadores como pontenciais compostos de defesa para serem usados no agronegócio. Eles apresentam mecanismos de ação diferentes dos compostos disponíveis comercialmente. O objetivo deste trabalho foi, por técnicas proteômicas, bioprospectar o potencial antimicrobiano de frações enriquecidas em peptídeos de folhas de pimentão (Capsicum annum Magali R ) contra fitopatógenos de importância comercial, objetivando aplicação biotecnológica. Folhas de pimentão foram maceradas com tampão Tris acrescido de inibidores de proteases, o homogenato foi centrifugado, e o sobrenadante foi nomeado extrato solúvel (ES). O precipitado foi ressuspendido em solução de LiCl contendo inibidores de proteases, o homogenato foi centrifugado e o sobrenadante foi denominado extrato de parede celular (EP). Com o objetivo inicial de confirmar a presença de AMPs, os extratos de pimentão foram fracionados com sal (Sulfato de Amônio) e por cromatografias de exclusão molecular (CEM) e hidrofóbica (CH). P2-ES1 e P2-EP1 obtidas após a CEM, deram origem respectivamente a nove (H1 a H9) e oito (H1 a H8) picos promissores à avaliação antimicrobiana quando separados por CH, observando-se que P2-EP1 corresponde a uma fração menos complexa enriquecida em peptídeos. As frações H3 e H4 de P2-EP1 apresentaram alta atividade inibitória para duas bactérias-teste avaliadas, Ralstonia solanacearum (Gram-negativa) e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Gram-positiva). Com o objetivo de simplificar o processo para futuras aplicações comerciais, procedimentos de ultrafiltração (1-10 kDa) substituíram os passos cromatográficos. Além das bactérias mencionadas acima, as frações recuperadas após ultrafiltração (ES1-10 e EP1-10) foram também capazes de inibir o crescimento da bactéria Erwinia carotovora subsp. carotovora e do fungo Alternaria solani. O crescimento das bactérias Pseudomonas syringae pv. tomato e Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, e dos fungos Fusarium solani, Alternaria brassicicola, Pyricularia grisea e Rhizoctonia solani não foi inibido pelo extratos peptídicos. O procedimento de ultrafiltração foi essencial para a recuperação de grande quantidade de amostra parcialmente fracionada enriquecida em peptídeos. A etapa de ultrafiltração corresponde a um procedimento fácil, rápido e de baixo custo. E especialmente permite a recuperação de amostras nativas para ensaios biológicos. Para estudos analíticos das amostras, ES1-10 e EP1-10 foram submetidos à cromatografia de fase reversa em HPLC usando resinas C18 e C4 para purificação dos extratos. Para ES1-10 foram encontrados 13 picos promissores, e para EP1-10, 2 picos após C18-RPHPLC. Foi verificada a presença de bandas peptídicas após RP-C18- HPLC, principalmente no pico 3 de ES1-10, quando este foi ressubmetido à RP-C4-HPLC, originando o pico 3.1, que foi então submetido ao sequenciamento de aminoácidos. Por espectrometria de massa (MALDI/TOF-TOF), foram encontradas massas moleculares inferiores a 10 kDa para diversos picos provenientes da C18-RP-HPLC, e as seqüências aminoacídicas encontradas até então não apresentaram similaridade a peptídeos antimicrobianos relatados na literatura. Estes extratos antimicrobianos podem ser biotecnologicamente explorados para aplicação comercial como compostos de defesa.

Antimicrobial peptides (AMPs) have being considered by researchers as potential defense compounds to be used in agribusiness. They present action mechanisms different from that of the available commercial compounds. The objective of this work was, by using proteomic tools, bioprospect the antimicrobial potential of peptide- enriched fractions from bell pepper (Capsicum annum `Magali R´) leaves against plant pathogens of commercial importance, aiming biotechnological application. Leaves of bell pepper were macerated with Tris buffer added of protease inhibitors, the homogenate was centrifuged, and the supernatant was named soluble extract (SE). The precipitate was resuspended in LiCl solution containing protease inhibitors, centrifuged and the supernatant was named cell wall extract (CWE). With the initial aim of assessing the presence of AMPs, the extracts of bell pepper were fractionated with salt, and by molecular exclusion (MEC) and hydrophobic (HC) chromatographies. P2-ES1 and P2-EP1 were obtained after MEC and produced respectively nine (H1-H9) and eight (H1-H8) promising antimicrobial peaks from HC. It could be observed that P2-EP1 is a lesscomplex peptide-enriched fraction. H3 and H4 fractions obtained from CWE1-P2 presented high inhibitory activity of two test-bacteria evaluated, Ralstonia solanacearum (Gram-negative) and Clavibacter michiganensis ssp. michiganensis (Gram-positive). With the aim also to simplify the process for further commercial application, ultra-filtration procedures (1-10 kDa) replaced the chromatographic steps. Besides the above mentioned bacteria, the recovered fractions after ultra-filtration (SE1-10 and CWE1-10) were also able to inhibit the bacterium Erwinia carotovora ssp. carotovora and the fungus Alternaria solani. The growth of the bacteria Pseudomonas syringae pv. tomato and Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, and of the fungi Fusarium solani, Alternaria brassicicola, Pyricularia grisea and Rhizoctonia solani was not inhibited by the peptide extracts. The ultra-filtration procedure was essential for recovering great amounts of partially purified samples, that were enriched in peptides. The step of ultra- filtration corresponds to a easy, fast, and low cost procedure, and allows especially the recovering of native samples for biological assays. For analytical studies of these samples, SE1-10 and CWE1-10 were submitted to reversed-phase chromatographies on C18 and C4-column. When a C18-RP-HPLC column was used, 13 promising peaks were recovered from ES1-10, and 2 peaks from EP1-10. Peptide bands was detected mainly in the peak 3 from ES1-10. This peak was resubmitted to a RP-HPLC in a C4 column, the produced peak 3.1 was recovered and analyzed for the amino acid sequence. By mass spectrometry (MALDI / TOF-TOF), we found molecular weights smaller than 10 kDa to several peaks from the C18-RP-HPLC, and the amino acid sequences found so far showed no similarity to antimicrobial peptides reported in the literature. These antimicrobial extracts can be biotechnologically exploited for commercial application as defense compounds.