Identificação e purificação de uma β-glicosidase extracelular e construção de vetores para expressão constitutiva de celulases em Kluyveromyces marxianus UFV-3

Abstract

Kluyveromyces marxianus é uma levedura com muitas características desejáveis para o desenvolvimento de um eficiente processo de produção de etanol a partir da sacarificação e fermentação simultâneas de biomassas: elevada taxa de crescimento, utilização de uma ampla variedade de açúcares, eficiente sistema de secreção de proteínas e a capacidade de fermentação em temperaturas próximas a 42ºC. A expressão heteróloga de celulases termoestáveis em K. marxianus têm sido o foco de várias pesquisas. O vetor pKLAC1-adh2p, para expressão constitutiva de celulases em K. marxianus, foi construído no Laboratório de Biotecnologia Molecular (LBM/UFV). Neste trabalho o gene de uma β-glicosidase de Aspegillus niger foi clonado e inserido no pKLAC1-adh2p. O cassete de expressão, pKLAC1-adh2p-bgl1, foi utilizado para transformação de K. marxianus UFV-3, porém o processo de seleção não foi eficiente e, durante a triagem por leveduras transformantes, foi observada a capacidade da levedura K. marxianus de secretar uma β-glicosidase. Dessa forma, enquanto trabalhos de padronização de um eficiente sistema de expressão heteróloga em K. marxianus vêm sendo desenvolvidos no laboratório (LBM/UFV), esta β-glicosidase extracelular de K. marxianus foi caracterizada. A metodologia de superfície de resposta foi utilizada para otimizar o processo de produção e determinar os parâmetros pH e temperatura ótimos para a atividade da β-glicosidase extracelular. As melhores condições do meio para produção foram 4% de glicose, pH 5,5 e incubação a 35°C. A maior atividade enzimática foi obtida em pH 5,5 e 55°C. Ensaios de termoestabilidade determinaram uma meia-vida de 4 horas para a enzima, quando incubada a 60°C. A análise de especificidade por substratos mostrou que a enzima foi capaz de hidrolisar celobiose, p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo, o-nitrofenil-β-Dglicopiranosídeo, p-nitrofenil-β-cellobiosídeo e p-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo. A enzima foi purificada por eletroforese não desnaturante em gel de poliacrilamida (PAGE) e análise de zimograma. A análise por SDS-PAGE revelou duas bandas majoritárias em torno de 45 KDa, que foram submetidas à digestão tríptica em gel e analisadas por espectrometria de massas (MS/MS). A proteína foi identificada como uma β-glicosidase. Para finalizar este trabalho, a β-glicosidase foi purificada por ultrafiltração e cromatografia de troca aniônica. O processo de purificação foi acompanhado por ensaio enzimático utilizando p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo como substrato e SDS-PAGE. Estes resultados mostram pela primeira vez uma β- glicosidase secretada por uma levedura fermentadora, isto abre a possibilidade para o uso de desta levedura para produção de etanol celulósico, já que os custos com a utilização de celulases ainda inviabilizam economicamente o processo.

Kluyveromyces marxianus is a yeast with many beneficial properties for the development an efficient process for producing ethanol from simultaneous saccharification and fermentation of biomass: a high growth rate, the utilization of a wide range of sugar types, a efficient system for protein secretion and fermentation capacity at temperatures around 42 ºC. The heterologous expression of thermostable cellulases in K. marxianus have been the focus of many researches. The vector pKLAC1-adh2p, for constitutive expression of cellulases in K. marxianus, was constructed at Laboratory of Molecular Biotechnology (LBM/UFV). In this study, the gene of a β-glucosidase from Aspegillus niger was cloned and inserted into pKLAC1-adh2p. The expression cassette, pKLAC1-adh2p-bgl1 was used for transformation of K. marxianus UFV-3, but the selection process was not efficient, and during screening of transformants yeasts, we observed the ability of the yeast K. marxianus to secrete a β-glucosidase. Thus, while works on standardization of an efficient system for heterologous expression in K. marxianus have been developed in laboratory (LBM/UFV), this β-glucosidase extracellular from K. marxianus was characterized. Theresponse surface methodology was used to optimize the production process and determine the parameters pH and temperature for enzyme activity. The best conditions for production were glucose 4%, pH 5.5 and incubation at 35°C. The highest activity was obtained at pH 5.5 and 55°C. Thermostability tests determined a half-life of 4 hours for the enzyme, when incubated at 60 ° C. Analysis of substrate specificity showed that the enzyme was able to hydrolyze cellobiose, p-nitrophenyl-β-Dglucopyranoside, o-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside, p-nitrophenyl-β-cellobioside and p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside. The enzyme was purified by non-denaturing electrophoresis in polyacrylamide gel (PAGE) and zymogram analysis. The SDS-PAGE analysis revealed two major bands around 45 KDa, which were submitted at in-gel trypsin digestions and analyzed by mass spectrometry (MS/MS). The protein was identified as a β-glucosidase. To finish this work, the β-glucosidase was purified by ultrafiltration and anion exchange chromatography. The purification process was monitored by enzymatic assay using p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside as substrate and SDS-PAGE. These results show for the first time a β-glucosidase secreted in a fermentative yeast, this opens the possibility to use this yeast for cellulosic ethanol production, since the costs with the use of cellulases makes the process uneconomical.