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Tipo: Dissertação
Título: Expressão heteróloga de celulases em Kluyveromyces marxianus para utilização em bioprocesso consolidado de produção de etanol celulósico
Título(s) alternativo(s): Heterologous expression of cellulases in Kluyveromyces marxianus for cellulosic ethanol production by consolidated bioprocess
Autor(es): Rodrigues, Marina Quádrio Raposo Branco
Primeiro Orientador: Fietto, Luciano Gomes
metadata.dc.contributor.advisor-co1: Passos, Flávia Maria Lopes
metadata.dc.contributor.advisor-co2: Ribon, Andréa de Oliveira Barros
metadata.dc.contributor.referee1: Silveira, Wendel Batista da
metadata.dc.contributor.referee2: Oliveira, Leandro Licursi de
Abstract: O alto custo de celulases constitui uma das principais barreiras para a bioconversão de lignocelulose em etanol, e o acoplamento da produção de celulases à sacarificação e fermentação simultânea do bagaço, em Bioprocesso Consolidado, pode contribuir para a viabilização deste processo. Para tanto, seria necessário um agente biocatalizador, ou um consórcio de micro-organismos, capaz de secretar enzimas celulolíticas e fermentar os açúcares resultantes a etanol. A levedura Kluyveromyces marxianus desponta no cenário biotecnológico de produção de etanol por apresentar características chave - como termotolerância, capacidade de produção de etanol em ambiente aerado e alto potencial para secreção de proteínas - para uso em Bioprocesso Consolidado. Neste trabalho, K. marxianus UFV-3 foram transformadas com cassetes de expressão contendo os genes eng1 ou cbhA de A. niger, que codificam respectivamente uma endoglucanase e uma celobiohidrolase, com secreção dirigida pelo peptídeo sinal α-MF de K. lactis, sob controle do promotor PGK de S. cerevisiae, e a marca de seleção kanMX. Foram obtidos clones cbhA com expressão e secreção diferencial, em relação à cepa não transformada, sugerindo que o promotor PGK, de S. cerevisiae, e o peptídeo sinal α-MF, de K. lactis, são reconhecidos pela maquinaria de expressão e secreção de K. marxianus UFV-3. A caracterização de um clone cbhA, com maior secreção de celobiohidrolase recombinante, sugere que a expressão heteróloga leva a mudanças metabólicas e no perfil de secreção de proteínas nas células recombinantes. A Metodologia de Superfície de Resposta foi utilizada para estudo e otimização das condições de cultivo que favorecem a secreção de proteínas endógenas e heteróloga em K. marxianus UFV-3. Nossos resultados indicam que o crescimento micelial de K. marxianus, observado em condições limitantes de crescimento, está altamente relacionado ao aumento da secreção de proteínas nestas condições. Os resultados apresentados sobre a manipulação genética e condições que favorecem a secreção de proteínas em K. marxianus UFV-3 abrem perspectiva para a obtenção de um consórcio de leveduras recombinantes e selvagens - com capacidade de secreção de celulases, hidrólise da celulose e fermentação dos açúcares resultantes - para aplicação em Bioprocesso Consolidado na produção de etanol celulósico.
The high cost of cellulase is one of the main barriers for the bioconversion of lignocellulose to ethanol, and the coupling of cellulase production and the simultaneous saccharification and fermentation of bagasse, in the Consolidated Bioprocessing, can contribute to the viability of this process. This strategy requires a biocatalyst agent, or a consortium of micro-organisms, able to secrete cellulolytic enzymes and ferment the resulting sugars to ethanol. The yeast Kluyveromyces marxianus emerges in the biotechnological scenario of ethanol production by presenting key features - such as thermotolerance, production capacity of ethanol in aerated environment and high potential for protein secretion - for use in Consolidated Bioprocessing. In this work, K. marxianus UFV-3 were transformed with expression cassettes containing the cbhA or eng1 A. niger genes, which respectively encode an endoglucanase and a cellobiohydrolase, with secretion directed by the K. lactis α-MF signal peptide, under control of the S. cerevisiae PGK promoter, and the selection mark kanMX. cbhA clones were obtained with differential expression and secretion of cellobiohydrolase, in relation to non-transformed strain, suggesting that the S. cerevisiae PGK promoter, and the K. lactis α-MF signal peptide are recognized by the machinery of expression and secretion of K. marxianus UFV-3. The characterization of a cbhA clone, with increased secretion of recombinant cellobiohydrolase, suggests that the heterologous expression of recombinant proteins leads to changes in metabolic profile and secretion in the cells. The Response Surface Methodology was used to study and optimization of culture conditions that favor the secretion of endogenous and heterologous proteins in K. marxianus UFV-3. Our results indicate that the mycelial growth of K. marxianus, observed in limiting conditions of growth, is closely related to increased secretion of proteins in these conditions. The results presented here about genetic manipulation and culture conditions that promote protein secretion in K. marxianus UFV-3 open perspectives for obtaining a consortium of yeast, with recombinant and wild strains, - with ability to secrete cellulases, to hydrolyze cellulose and to ferment derived sugars - for use in Consolidated Bioprocessing on cellulosic ethanol production.
Palavras-chave: Kluyveromyces marxianus
Bioprocesso
Etanol
Kluyveromyces marxianus
Bioprocess
Ethanol
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR
Idioma: por
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
metadata.dc.publisher.department: Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal
metadata.dc.publisher.program: Mestrado em Bioquímica Agrícola
Citação: RODRIGUES, Marina Quádrio Raposo Branco. Heterologous expression of cellulases in Kluyveromyces marxianus for cellulosic ethanol production by consolidated bioprocess. 2012. 121 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2012.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2441
Data do documento: 6-Fev-2012
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