Caracterização de biofilmes multiespécies formados por bactérias isoladas de leite

Abstract

Biofilmes multiespécies formados em equipamentos na indústria do leite resultam em diversos problemas na qualidade dos produtos, para a saúde dos consumidores, além de prejuízos financeiros. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência dos fatores como temperatura e nutrientes na estrutura e composição química do biofilme multiespéciess bacteriano utilizando técnicas microscópicas e espectroscopia vibracional. Buttiauxella agrestis, Rahnella inusitata, Pseudomonas fluorescens, Staphylococcus aureus, Lactococcus laudensis e Lactococcus garviae, isolados de biofilmes formados na presença de leite cru a 7 °C, foram avaliados quanto a capacidade de formação de biofilme em microplacas de poliestireno contendo leite em pó reconstituído (LDR) a 1% e 10% como meio de cultivo, às temperaturas de 7 °C e 25 °C. Os melhores formadores de biofilmes individuais e multiespécies nas condições avaliadas foram P. fluorescens e S. aureus e estas espécies foram selecionadas para a continuidade dos estudos. Biofilmes em cultura pura ou em co-cultivo de P. fluorescens e S. aureus foram formados a 7 °C em superfície de aço inoxidável por 10 dias. O meio de cultivo e inóculo foram trocados a cada dois dias e foram feitas análises de quantificação de células aderidas, observação em microscópio de epifluorescência e de varredura e, a composição do biofilme foi avaliada pela técnica de espectroscopia Raman. O crescimento das bactérias em co-cultivo não afetou o número de células no biofilme formado em aço inoxidável quando comparado com o biofilme individual. Nos biofilmes formados por P. fluorescens na presença de LDR 1% foi constatado maior número de células sésseis (P > 0,05) quando comparado ao LDR 10% no 6° dia de incubação. As imagens obtidas na microscopia de epifluorescência e de varredura corroboram os resultados da quantificação do número de células, com a população de P. fluorescens superior à de S. aureus em biofilmes simples e em co-cultivo. A partir da espectroscopia Raman foi possível observar a homogeneidade dos biofilmes e que todos os biofilmes formados eram compostos por carboidratos, proteínas, lipídeos e DNA. No entanto, as intensidades dos picos Raman de cada componente variaram de acordo com a espécie e a concentração de LDR utilizada. Pode-se concluir que na temperatura de 7 °C P. fluorescens formam biofilme individualmente ou multiespécie na superfície de aço inoxidável na presença de resíduos de leite, o que constitui um problema para a indústria laticinista. O conhecimento obtido sobre a composição do biofilme desses microrganismos contribuirá para a busca de métodos para evitar a formação dos biofilmes bem como para a sua remoção. Palavras-chave: Multiespécies. Resíduos de leite. Raman.

Multispecies biofilm formed in the dairy industry's equipment result in several problems in the quality of products, financial losses, and health risks. The present work's objective was to evaluate the influence of factors such as temperature and nutrients on the structure and chemical composition of the bacterial multispecies biofilm using microscopic techniques and vibrational spectroscopy. Buttiauxella agrestis, Rahnella inusitata, Pseudomonas fluorescens, Staphylococcus aureus, Lactococcus laudensis, and Lactococcus garviae isolated from biofilm formed in the presence of raw milk at 7 °C were evaluated for biofilm formation capacity in polystyrene microplates containing 1% and 10% reconstituted whole milk (RWM) at 7 °C and 25 °C. The best individual and multispecies biofilm makers in the evaluated conditions were P. fluorescens and S. aureus, and these species were selected for further studies. Biofilms in pure culture or co-culture were formed at 7 °C on a stainless steel surface for 10 days. The culture medium and inoculum were changed every two days, and analyzes were performed to quantify adhered cells. Observation of under an epifluorescence and scanning microscope was done to evaluate biofilm formation and structure, and Raman's spectroscopy technique evaluated the biofilm composition. The growth of bacteria in co-cultivation did not affect the number of cells of both species in the biofilm formed in stainless steel. In biofilms formed in the presence of 1% RWM, a greater number of sessile cells was found (P > 0.05) when compared to the 10% RWM on the 6th day of incubation. The images obtained in the epifluorescence and scanning microscopy corroborate the quantification results of the number of cells. The population of P. fluorescens was greater than that of S. aureus in single and multispecies biofilms. Raman spectroscopy allowed observing the homogeneity of biofilms and that all biofilms formed were composed of carbohydrates, proteins, lipids, and DNA. However, the Raman peaks' intensities varied according to the species and substrate. It can be concluded that at a temperature of 7 °C, P. fluorescens form biofilms individually or multispecies on the stainless steel surface in milk residues, which shows a problem for the dairy industry. With the knowledge obtained about the biofilm composition of these microorganisms, it is essential to seek methods to prevent the formation of biofilms and their removal. Keywords: Multiespécies. Waste of milk. Raman.