Proposição de um coquetel fágico para controle de biofilmes de bactérias redutoras de sulfato em ambientes relacionados à indústria de óleo e gás

Abstract

Na indústria petrolífera, os biofilmes formados por Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS) causam grandes danos relacionados à corrosão de tanques e tubulações, além da produção de gases tóxicos como o H 2 S. Os biocidas químicos, atualmente mais utilizados para o controle desses microrganismos, são frequentemente ineficazes contra biofilmes. Assim, os bacteriófagos (ou fagos) tem sido estudado como agentes alternativos de tratamento. Fagos são vírus que infectam bactérias e podem degradar substâncias poliméricas na matriz do biofilme, expondo as bactérias à infecção por novas partículas virais ou à estresses físicos e químicos. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo formular coquetéis de fagos e avaliar seu potencial no controle do biofilme formado por uma cultura mista de BRS de composição desconhecida. Para isso, 10 fagos foram isolados de amostras de esgoto e analisados por microscopia eletrônica de transmissão (MET). Bactérias de crescimento rápido foram então usadas para triar os fagos isolados quanto ao potencial para reduzir a formação de biofilme e para avaliar o espectro de hospedeiro. O espectro do hospedeiro foi investigado pela análise da curva de crescimento de cada bactéria e o potencial para reduzir a formação de biofilme foi investigado pela quantificação da biomassa do biofilme. Como todos os fagos mostraram-se promissores no controle desses biofilmes, todos foram testados separadamente contra a cultura de BRS. A partir dos resultados obtidos com os fagos testados separadamente, 6 coquetéis foram formulados pela combinação dos isolados, que foram então testados para o controle da formação de biofilme pela cultura de BRS. Os fagos dos coquetéis também foram analisados quanto à estabilidade após incubação em diferentes condições de temperatura e pH, bem como em água do mar. A análise microscópica revelou a presença de 4 miovírus, 3 sifovírus e 3 podovírus. Três desses isolados foram capazes de infectar mais de um gênero bacteriano, sendo, portanto, fagos polivalentes. Todos os fagos foram capazes de, separadamente, reduzir a formação de biofilme de pelomenos uma espécie bacteriana não hospedeira, e 5 foram capazes de reduzir a formação de biofilme pela cultura de BRS. Três dos seis coquetéis testados, Coq3, Coq5 e Coq6, reduziram a formação de biofilme pela cultura de BRS em 15%, 44% e 43%, respectivamente. Embora Coq5 tenha mostrado a maior porcentagem de redução (embora com pouca diferença de Coq6), Coq6 foi o mais promissor, uma vez que esses fagos tiveram melhor estabilidade nas diferentes condições estudadas em comparação com os fagos do Coq5. Todos os fagos do Coq6 permaneceram completamente estáveis quando incubados em água do mar e apresentaram viabilidade acima de 50% quando incubados em pH 4, características interessantes para uma aplicação de campo na indústria petrolífera onde baixos valores de pH e alta salinidade podem ser alcançados. Análises futuras de sequenciamento de genoma dos fagos e a identificação das espécies que compõem a cultura de BRS, bem como análise dos componentes do biofilme, devem ser realizadas para obter uma melhor compreensão das relações fago-biofilme. Em conclusão, a abordagem para seleção de coquetéis parece ser uma estratégia promissora. Palavras-chave: Bacteriófagos. Biocontrole. Fagos polivalentes.

In the oil industry, biofilms formed by Sulfate Reducing Bacteria (SRB) cause great damage related to corrosion of tanks and pipes, in addition to the production of toxic gases such as H 2 S. Chemical biocides, currently most used to control these microorganisms, are often ineffective against biofilms. Thus, bacteriophages (or phages) have been studied as alternative treatment agents. Phages are viruses that infect bacteria and can degrade polymeric substances in the biofilm matrix, exposing the bacteria to infection by new viral particles or physical and chemical stresses. In this context, the present work aimed to formulate phage cocktails and evaluate their potential to control the biofilm formed by an SRB mixed culture of unknown composition. For this, 10 phages were isolated from sewage samples and analyzed by transmission electron microscopy (TEM). Fast-growing bacteria were then used to screen the isolated phages for their potential to reduce biofilm formation and to assess their host spectrum. The host spectrum was investigated by analyzing the growth curve of each bacteria and the potential to reduce biofilm formation was investigated by quantifying the biofilm biomass. As all phages showed promise in controlling these biofilms, they were all tested separately against the SRB culture. From the results obtained with the phages tested separately, 6 cocktails were formulated by combining the isolates, which were then tested to control biofilm formation by the SRB culture. The cocktail phages were also analyzed for stability after incubation under different conditions of temperature and pH, as well as in seawater. Microscopic analysis revealed the presence of 4 myoviruses, 3 siphoviruses and 3 podoviruses. Three of these isolates were able to infect more than one bacterial genus, being, therefore, polyvalent phages. All phages were able to, separately, reduce biofilm formation of at least one non-host bacterial species, and 5 were able to reduce biofilm formation by SRB culture. Three of the six cocktails tested, Coq3, Coq5 and Coq6, reduced biofilm formation by BRS culture by 15%, 44% and 43%, respectively. Although Coq5 showed the highest percentage reduction (albeit with little difference from Coq6), Coq6 was themost promising, as these phages had better stability under the different conditions studied compared to Coq5 phages. All Coq6 phages remained completely stable when incubated in seawater and showed viability above 50% when incubated at pH 4, interesting characteristics for a field application in the oil industry where low pH values and high salinity can be achieved. Future analysis of phage genome sequencing and identification of species that make up the BRS culture, as well as analysis of biofilm components, should be performed to gain a better understanding of phage-biofilm relationships. In conclusion, the cocktail selection approach seems to be a promising strategy. Keywords: Bacteriophages. Biocontrol. Polyvalent phages.