Análise dos mecanismos de splicing alternativo em resposta ao déficit hídrico em soja (Glycine max)

Abstract

A soja [Glycine max (L.) Merr.] hoje em dia é uma das culturas de maior importância para o agronegócio mundial. O Brasil se posiciona como o segundo maior produtor mundial desta cultura, com mais de 30% da produção, atrás apenas dos Estados Unidos. Porém, nos últimos anos, a soja vem sofrendo grandes perdas em função das adversidades climáticas, apresentando enorme sensibilidade a alterações de frio, calor, chuvas e principalmente escassez hídrica, responsável pelas maiores perdas, impedindo uma maior produtividade e expansão agrícola para outras regiões. A solução para essas perdas seria o desenvolvimento de técnicas mais eficazes de plantio e produção, bem como o desenvolvimento de variedades genotípicas mais tolerantes à escassez hídrica. Dessa forma, nosso principal objetivo é a busca pela melhor elucidação de mecanismos e vias relacionadas ao estresse hídrico por predição em bioinformática analisando o transcriptoma após estresse. Portanto, estudos transcriptômicos oferecem uma visão dos mecanismos de resposta ao estresse das plantas. Aqui, apresentamos os resultados do perfil global de expressão gênica de folhas de dois cultivares de soja, BR16 e EMBRAPA48, com capacidade contrastante para lidar com o déficit hídrico, utilizando metodologia de sequenciamento de RNA. Para as análises iniciais do transcriptoma, a qualidade das sequências foi avaliada com o programa FastQC. Posteriormente, nós realizamos o alinhamento contra o genoma de referência da soja usando o alinhador Bowtie/TopHat, em seguida avaliado o perfil de expressão gênica pelo pacote Cufflinks/Cuffdiff, que mostraram uma gama de genes que foram alterados em função do estresse, com uma perturbação mais branda para a variedade mais tolerante EMBRAPA48. Nossa análise sugere que a tolerância à seca resulta de um certo nível de transcrição de genes que predispõem a planta mesmo antes do início da seca. No splicing alternativo diferentes éxons e íntrons de um mesmo pré- RNA mensageiro podem ser excluídos ou retidos para produzir diferentes RNAs maduros, expandindo o repertório do transcriptoma. Análises de expressão diferencial em nível de transcritos podem detectar alterações na expressão de isoformas do transcrito, a partir de um mesmo gene. Portanto, no presente estudo, nós avaliamos a ocorrência de ivsplicing alternativo diferencial. Inicialmente realizamos o alinhamento contra o genoma de referência de Soja usando o alinhador splice-aware STAR. Após o alinhamento, o programa rMATS foi usado para detectar os principais tipos de splicing alternativo. Em nossos resultados mostramos que o Alternativo 3’ e Skipped exon foram os eventos de maior ocorrência para ambas variedades. Nossos dados sugerem que eventos de splicing alternativo são diferencialmente regulados em consequência da submissão ao estresse hídrico e revelam um mecanismo potencial na regulação da expressão de genes com importantes funções na tolerância ao estresse. Diante das análises de Ontologia revelou que os genes DAS estavam envolvidos principalmente em processos biológicos, incluindo resposta celular ao estresse como a biossíntese de polissacarídeos de membrana (dentre as quais se encontram a biossíntese de glicanos, betaglicanos e UDP-raminose), reparo da região 3’ de DNA, transporte de auxina, regulação do desenvolvimento floral e resposta ao estímulo abiótico como manutenção do potencial hídrico das folhas. Dessa forma a avaliação da expressão de genes e do splicing alternativo do transcriptoma de soja para as variedades contrastantes nos fornecem entendimento de como ocorre a regulação da expressão diferencial bem como a descrição de mecanismos e vias para tolerância ao estresse hídrico.

Soybean [Glycine max (L.) Merr.] is one of the most important cultures for agribusiness worldwide. Brazil is the second largest grower of this culture, with over 30% of its production, surpassed only by the United States. However, in the past few years, soybean has suffered great losses due to climate adversities, presenting enormous sensibility due to changes in heat, cold, rain and mostly hydric shortage, responsible for the largest losses. This context prevents more productivity and breaks agricultural expansion to other regions. The solution for this losses is the development of more effective techniques for growth and production of soybean, as well as the development of genotypic varieties with more tolerance to hydric shortage. Thus, our main goal is the elucidation of mechanisms and pathways related to hydric stress by bioinformatics prediction, analysing the transcriptome after stress. Therefore, transcriptomic studies offer a view of response mechanisms to plant stress. This study presents the global profile results of gene expression of two soybean types, BR16 and EMBRAPA48, with contrastant capacities to deal with hydric deficit, using RNA sequence methodology. For transcriptome initial analysis, the quality of the sequences was evaluated with FastQC software. Afterwards, the alignment against the soybean reference genome was made using the Bowtie/TopHat aligner, followed by the evaluation of the gene expression profile using Cufflinks/Cuffdiff package. The results showed an amount of genes that were altered due to stress, with a milder disturbance in the more tolerant variety, EMBRAPA48. The analysis suggests that the drought tolerance occurs due to a certain level of gene transcription that predisposes the plant even before the beginning of the drought. In alternative splicing different exons and introns of one same messenger pre-RNA may be excluded or retained for the production of different mature RNAs, expanding the repertoire of the transcriptome. Differential expression analysis in transcripts level can detect alterations in transcripts isoforms from one specific gene. Therefore, in the present study, we evaluate the occurrence of differential alternative splicing. Initially, the alignment against the soybean reference genome was made using the splice-aware STAR aligner. After the alignment, rMATS software was used to detect the main types of alternative splicing. The results show that Alternative 3’ and viSkipped exon were the events of major occurrence for both varieties. The data suggests that the alternative splicing events are differentially regulated due to hydric stress submission and reveal a potential mechanism for gene expression regulation of important functions in stress tolerance. Ontology analysis revealed that the DAS genes were involved mainly in biological processes, including cellular response to stress, such as the biosynthesis of membrane polysaccharides (glycan, betaglycan, UDP- raminose, among others), DNA repair in the 3’ region, auxin transportation, flower development regulation and response to abiotic stimulation as maintenance of the leaves hydric potential. Thus, the evaluation of gene expression and alternative splicing of the soybean transcriptome for contrastant varieties provides the understanding of the differential expression and the description of mechanisms and pathways for hydric stress tolerance.