Transcriptoma, proteoma e cinética das proteases intestinais de lagarta da soja: características da resposta bioquímica a inibidores de proteases de natureza proteica

Abstract

Os inibidores de protease (IP) produzidos pelos vegetais têm um amplo espectro de proteases- alvo. No entanto, as pragas agrícolas encontraram formas de debelar os efeitos negativos dos IP de suas plantas hospedeiras. Para compreender os mecanismos moleculares e fisiológicos envolvidos na interação inseto-planta, a lagarta da soja (Anticarsia gemmatalis) e a soja (Glycine max) foram utilizadas como animal e planta modelo. Por meio de diferentes abordagens bioquímicas e biológicas, este trabalho apresentou as hidrolases intestinais da A. gemmatalis com elevada cobertura mediante à metodologia de 1DE-LC/MS proposta. Essa estratégia, apresentada de forma inédita, possibilitou a identificação de 98 hidrolases não redundantes, compreendendo isoformas importantes no mecanismo adaptativo do inseto a IP de plantas. As variações ocorridas nesse proteoma foram avaliadas expondo a lagarta a IP. Os resultados mostraram modulações fisiológicas que foram capazes de driblar os efeitos negativos dos inibidores. Houve aumento de isoformas responsáveis por atividades proteolíticas bem como aumento de proteínas relacionadas a processos de estresse. A presença de IP na dieta causou respostas nas atividades enzimáticas que revelaram uma melhor adaptação da lagarta ao IP natural da soja quando comparado a inibidores sintéticos. As análises de docking molecular mostraram a termodinâmica e os sítios de ligação envolvidos no complexo enzima-inibidor (EI), revelando características importantes para um IP eficiente. Usando esse conhecimento como base, um tripeptídeo (GORE2) foi racionalmente desenhado para atuar como inibidor de tripsinas-like de A. gemmatalis. O transcriptoma do intestino da lagarta mostrou que a presença do GORE2 e do SKTI, inibidor natural da soja, foram responsáveis por 1474 genes diferencialmente expressos, revelando importantes enzimas envolvidas na resposta do inseto. O GORE2 proposto mostrou-se mais eficiente que o SKTI ao provocar danos celulares no epitélio intestinal. Os danos mais intensos e extensos provocados pelo inibidor peptídico foram acompanhados por estresse oxidativo e pela baixa eficiência na resposta do inseto para se desintoxicar do estresse oxidativo por meio de enzimas antioxidantes. Esses resultados permitiram um melhor entendimento sobre o arsenal bioquímico e molecular do herbívoro para propor um IP potente, abrindo caminho para novas abordagens no desenvolvimento de defensivos agrícolas ambientalmente corretos e eficientes no manejo de pragas. Palavras-chave: Anticarsia gemmatalis. Enzimologia. Glycine max. Manejo de pragas agrícolas. Proteômica.

Protease inhibitors (PIs) produced by plants have a broad spectrum of target proteases. However, agricultural pests have overcome the negative effects of PI on their host plants. To understand the molecular and physiological mechanisms involved in the insect-plant interaction, the soybean caterpillar (Anticarsia gemmatalis) and soybean (Glycine max) were used as an animal and plant model. Through different biochemical and biological approaches, this work presented the intestinal hydrolases of A. gemmatalis with high coverage through the proposed 1DE-LC/MS method. This strategy, presented unprecedentedly, allowed the identification of 98 non-redundant hydrolases, comprising important isoforms in the adaptive mechanism of the insect to plant PI. The variations that occurred in this proteome were evaluated by challenging the caterpillar with PI. The results showed physiological modulations that aimed to circumvent the negative effects of inhibitors. There was an increase in isoforms responsible for proteolytic activities, as well as an increase in proteins related to stress processes. The presence of PI in the diet caused responses in the enzymatic activities that revealed a better adaptation of the caterpillar to the natural PI of soybean when compared to synthetic inhibitors. Molecular docking analyzes showed the thermodynamics and binding sites involved in the enzyme-inhibitor (EI) complex, shedding light on important features of an efficient IP. Using this knowledge as a basis, a tripeptide (GORE2) was rationally designed to act as a trypsin-like inhibitor of A. gemmatalis. The transcriptome of the caterpillar intestine showed that the GORE2 and SKTI, a natural soybean inhibitor, handled 1474 differentially expressed genes, revealing important enzymes involved in the insect’s response. The proposed GORE2 proved to be more efficient than SKTI, in causing cellular damage to the intestinal epithelium. The most intense and extensive damage caused by the peptide inhibitor was accompanied by oxidative stress and the low efficiency in the insect’s response to detoxify itself from oxidative stress through antioxidant enzymes. These results allowed a better understanding of the herbivore’s biochemical and molecular arsenal to propose a potent IP, opening the way for new approaches in the development of environmentally friendly and efficient pesticides in pest management. Keywords: Anticarsia gemmatalis. Enzymology. Glycine max. Agricultural pest management. Proteomics.