Desenvolvimento de um imunoensaio cromatográfico rápido de fluxo lateral para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina, utilizando antígeno recombinante otimizado de Leishmania infantum

Abstract

A Leishmaniose Visceral é uma doença negligenciada que acomete populações em países de clima tropical e subtropical. O Brasil encontra-se entre os seis países com maior registro de novos casos no mundo. Os cães têm importante papel no ciclo de transmissão da leishmaniose, atuando como reservatório dos parasitos, uma vez que são suscetíveis à infecção e convivem próximos aos seres humanos. Apesar de existir um medicamento para tratamento da Leishmaniose Visceral Canina (LVC), o Programa de Controle da Leishmaniose Visceral (PCLV) do Ministério da Saúde, determina como uma das estratégias para controle e erradicação da doença o controle do reservatório canino através de inquérito sorológico seguido à eutanásia de cães sororreagentes. O inquérito sorológico tem se mostrado uma estratégia falha, no que se refere a eutanásia em cães sororreagentes e ao uso do TR DPP® LVC preconizado pelo MS para o diagnóstico da LVC. Dessa forma ainda é necessário o desenvolvimento de novos imunoensaios cromatográficos rápidos (LFIA) com melhor performance para evitar diagnóstico impreciso dos cães e melhorar o programa de controle da LVC. O antígeno alvo deste trabalho foi previamente caracterizado como bom antígeno recombinante para ensaio diagnóstico indireto de LVC por ELISA. Neste trabalho este antígeno foi otimizado in sílico, produzido de forma recombinante. Foram realizados testes com propósito produzir, estabilizar e avaliar a funcionalidade da proteína como antígeno no diagnóstico indireto por imunocromatografia. Nos testes de adsorção, o antígeno purificado foi capaz de formar ligações estáveis ao ouro coloidal e em testes preliminares de ensaio ELISA e tiras LFIA a proteína otimizada se mostrou um antígeno funcional, pois anticorpos específicos presente em amostra de soro de cão positiva para LVC, reconheceram e reagiram com a rLicNTPDase2-Gold.

Palavras-chave:

Leishmaniose visceral canina. Ensaio diagnóstico indireto. LFIA. Antígeno recombinante otimizado.

The Visceral Leishmaniasis is a sneaky disease that affects populations in tropical and subtropical countries. Brazil is one of the top six countries with the highest number of new cases in the world. Dogs play a crucial role in the transmission cycle of leishmaniasis, acting as hosts for the parasites since they can get infected and live close to humans. Although there is a medication for Canine Visceral Leishmaniasis (CVL), the Visceral Leishmaniasis Control Program (VLCP) determines one of the strategies for controlling and eradicating the disease is to control the canine reservoir through serological surveys followed by euthanasia of seropositive dogs. However, the serological surveys have proven to be ineffective when it comes to euthanizing seropositive dogs and using the Ministry of Health, recommended TR DPP® LVC for diagnosing CVL. Therefore, there is still a need for the development of new rapid chromatographic immunoassays (LFIA) with better performance to prevent inaccurate diagnosis of dogs and improve the CVL control program. The antigen targeted in this study was previously characterized as a good recombinant antigen for indirect ELISA diagnosis of CVL. In this study, the antigen was optimized in silico and produced recombinantly. Tests were conducted to produce, stabilize, and evaluate the functionality of the protein as an antigen in indirect immunochromatography diagnosis. In adsorption tests, the purified antigen was able to form stable bonds with colloidal gold, and in preliminary ELISA and LFIA strip tests, the optimized protein proved to be a functional antigen, since specific antibodies present in a positive dog serum sample for LVC, recognized and reacted with rLicNTPDase2-Gold.

Keywords:

Canine visceral leishmaniasis. Indirect diagnostic assay. LFIA. Optimized recombinant antigen.