Obtenção de um biossurfactante recombinante em levedura

Abstract

Emulsões são sistemas polifásicos formados pela mistura de líquidos imiscíveis, que geralmente apresentam interações intermoleculares repulsivas. Um dos principais desafios enfrentados pela indústria é preservar a estabilidade física das emulsões. A adição de moléculas capazes de reduzir a instabilidade dos sistemas emulsificados é uma estratégia para minimizar a tendência à separação de fases. Essas moléculas podem atuar de diferentes maneiras, como gerar repulsão entre as gotículas dispersas, aumentar a viscosidade da matriz contínua ou diminuir a tensão interfacial entre as fases imiscíveis. No caso em que ocorre a diminuição da tensão interfacial, as moléculas responsáveis por essa propriedade são denominadas surfactantes. De modo geral, os surfactantes possuem a capacidade de reduzir a tensão superficial da água de 72 para valores entre 50 e 35 mN/m através da diminuição da energia livre de superfície das partículas. Sob uma perspectiva industrial, os surfactantes têm uma relevância fundamental devido ao seu amplo uso na produção de detergentes, produtos têxteis, pigmentos, polímeros, fármacos, defensivos agrícolas e alimentos. No entanto, é importante considerar que, devido à sua origem derivada do petróleo, muitos surfactantes possuem alta toxicidade e apresentam uma degradação desafiadora no ambiente natural. A fim de encontrar surfactantes sustentáveis, renováveis e com menor toxicidade, nosso grupo de pesquisa investigou as propriedades tensoativas do extrato recombinante da levedura Komagataella phaffii, contendo a Proteína Associada a Grânulos de Azotobacter sp. FA8 (AzPhaP). A expressão foi realizada conciliado as técnicas de pressão seletiva por antibiótico, otimização do meio de indução e produção intra e extracelular do produto recombinante. A exportação da proteína azPhaP por meio das vias associadas ao peptídeo alfa revelou-se ineficaz. Nessas condições, foi observada uma retenção significativa da proteína recombinante dentro da célula, juntamente com uma redução acentuada no crescimento celular. O clone C6, transfectado com o plasmídeo para expressão intracelular, demonstrou uma produção destacada da proteína azPhaP em relação aos outros isolados avaliados. Sob condições de cultivo otimizadas, a expressão alcançou títulos de produção equivalentes a 4,4 mg/g. As emulsões de óleo e água, preparadas utilizando extratos celulares da levedura recombinante, apresentaram um índice de estabilidade significativamente maior em comparação com o grupo de controle. Em concentrações baixas, correspondentes a 0,170 mg/mL de azPhaP, quando combinadas com o extrato total, essas emulsões foram capazes de se estabelecer, sem evidentes indícios de separação ou quebra. A utilização dos extratos celulares recombinantes, demonstrou a capacidade de reduzir de forma acentuada a tensão superficial da água. Soluções contendo extrato proteico solúvel, com uma concentração de 10 mg/mL, correspondendo a 0,5 mg/mL de azPhaP, demonstraram uma média de tensão superficial de 46,425 mN/m. Por outro lado, soluções contendo 3% do extrato total (v/v), que continham concentrações equivalentes a 0,170 mg/mL de azPhaP, exibiram uma média de tensão superficial de 36,69 mN/m. Os resultados deste estudo sugerem que a incorporação de extratos celulares da levedura Komagataella phaffii, contendo a AzPhaP, pode ser uma estratégia promissora para o desenvolvimento de surfactantes mais eficazes, com potencial aplicação na indústria.

Palavras-chave:

Surfactantes. Leveduras. Proteínas.

Emulsions are polyphasic systems formed by the mixture of immiscible liquids, which generally exhibit repulsive intermolecular interactions. One of the main challenges faced by the industry is to preserve the physical stability of emulsions. The addition of molecules capable of reducing the instability of emulsified systems is a strategy to minimize the tendency for phase separation. These molecules can act in various ways, such as generating repulsion between the dispersed droplets, increasing the viscosity of the continuous matrix, or decreasing the interfacial tension between the immiscible phases. In cases where interfacial tension is decreased, the molecules responsible for this property are referred to as surfactants. In general, surfactants have the ability to reduce the surface tension of water from 72 to values between 50 and 35 mN/m by decreasing the surface free energy of the particles. From an industrial perspective, surfactants hold fundamental relevance due to their widespread use in the production of detergents, textiles, pigments, polymers, pharmaceuticals, agricultural chemicals, and food. However, it's important to consider that many surfactants, owing to their petroleum-derived origin, exhibit high toxicity and pose challenges for degradation in the natural environment. In order to discover sustainable, renewable, and less toxic surfactants, our research group investigated the surface-active properties of the recombinant extract from the yeast Komagataella phaffii, containing the Protein Associated with Azotobacter sp. FA8 Granules (AzPhaP). The expression was achieved by combining techniques of selective antibiotic pressure, optimization of induction medium, and intra- and extracellular production of the recombinant product. Exporting the AzPhaP protein via peptide alpha-associated pathways proved ineffective. Under these conditions, significant retention of the recombinant protein within the cell was observed, coupled with a pronounced reduction in cell growth. Clone C6, transfected with the plasmid for intracellular expression, exhibited a notable production of the AzPhaP protein compared to the other evaluated isolates. Under optimized cultivation conditions, expression reached production titers equivalent to 4.4 mg/g. Emulsions of oil and water, prepared using cellular extracts from the recombinant yeast, showed a significantly higher stability index compared to the control group. At low concentrations corresponding to 0.170 mg/mL of azPhaP, when combined with the total extract, these emulsions were able to establish themselves without evident signs of separation or breakdown. The use of recombinant cellular extracts demonstrated the ability to markedly reduce the surface tension of water. Solutions containing soluble protein extract, at a concentration of 10 mg/mL, corresponding to 0.5 mg/mL of azPhaP, exhibited an average surface tension of 46.425 mN/m. On the other hand, solutions containing 3% of the total extract (v/v), which contained concentrations equivalent to 0.170 mg/mL of azPhaP, displayed an average surface tension of 36.69 mN/m. The results of this study suggest that the incorporation of cellular extracts from the yeast Komagataella phaffii, containing AzPhaP, may be a promising strategy for the development of more effective surfactants with potential applications in the industry.

Keywords:

Surfactants. Yeasts. Proteins.