Análise funcional do RNA pequeno Rna01 na virulência de Actinobacillus pleuropneumoniae

Abstract

Actinobacillus pleuropneumoniae (App), o agente causador da pleuropneumonia suína (PPS), é uma bactéria fastidiosa pertencente à família Pasteurellaceae. O estabelecimento da infecção por App envolve a expressão de fatores essenciais para virulência como: exotoxinas, polissacarídeos capsulares, lipopolissacarídeos (LPS) e vesículas de membrana externa (OMVs). Os fatores de virulência podem ser regulados por RNAs pequenos reguladores (sRNA). Foram identificados 35 sRNAs em App, o que inclui o sRNA dependente de Hfq denominado Rna01. Análises de alvos para o sRNA01 mostraram RNAs mensageiros relacionados às vias metabólicas centrais e componentes estruturais de membrana. O mutante para o Rna01 mostrou potencial atenuação em análises preliminares com Galleria mellonella. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi investigar a funcionalidade do RNA pequeno regulador Rna01 na virulência de App e o potencial da linhagem WT_Δrna01 como candidata a vacina viva atenuada. Os resultados obtidos mostraram que a ausência do Rna01 afeta negativamente o crescimento e adesão, reduz a produção de EVs e altera seu perfil proteico. Os testes de sobrevivência com G. mellonella mostraram atenuação da linhagem WT_Δrna01 (sobrevivência de 72%) e aumento da melanização das larvas após 48 horas de infecção. Larvas inoculadas com EVs da linhagem WT_Δrna01 apresentaram menor taxa de sobrevivência (50%). Análises em cultura de macrófagos RAW 264.7 mostraram menor taxa de infecção e produção de óxido nítrico (NO) quando infectadas com o mutante WT_Δrna01. Além disso, a quantidade de bactérias internalizadas por macrófagos infectados também foi reduzida. Todavia, as concentrações das citocinas TNF-α e IL-6 foram iguais e/ou maiores, que as encontradas na linhagem selvagem. Deste modo, sugerimos que a linhagem WT_Δrna01 possa induz resposta do tipo Th17 e Th1 in vitro. Concluímos que o Rna01 afeta positivamente na virulência de App e a linhagem WT_Δrna01 é uma possível candidata a vacina viva atenuada, mas são necessárias análises complementares. Palavras-chave: Pleuropneumonia suína. RNAs pequenos reguladores. Citocinas. Vacina viva atenuada14

Actinobacillus pleuropneumoniae (App), the causative agent of swine pleuropneumonia (PPS), is a fastidious bacterium belonging to the Pasteurellaceae family. The establishment of App infection involves the expression of essential factors for virulence such as: exotoxins, capsular polysaccharides, lipopolysaccharides (LPS) and outer membrane vesicles (OMVs). Virulence factors can be regulated by small regulatory RNAs (sRNA). Were identified 35 sRNAs in App, which includes the Hfq-dependent sRNA called Rna01. Target analysis for sRNA01 showed messenger RNAs related to central metabolic pathways and structural membrane components. The Rna01 mutant showed the potential attenuation in preliminary analyzes with Galleria mellonella. Thus, the aim of this work was to investigate the functionality of the small regulatory RNA01 in App virulence and the potential of the WT_Δrna01 strain as a candidate for live attenuated vaccine. The results obtained showed that the absence of Rna01 negatively affects growth and adhesion, reduces the production of EVs and changes its protein profile. Survival tests with G. mellonella showed attenuation of the WT_Δrna01 strain (72% survival) and increased larval melanization after 48 hours of infection. Larvae inoculated with EVs of the WT_Δrna01 strain had a lower survival rate (50%). Culture analyzes of RAW 264.7 macrophages showed a lower infection rate and nitric oxide (NO) production when infected with the WT_Δrna01 mutant. In addition, the amount of bacteria internalized by infected macrophages has also been reduced. However, the concentrations of cytokines TNF-α and IL- 6 were the same and/or higher than those found in the wild strain. Thus, we suggest that the strain WT_Δrna01 may induce a Th17 and Th1 type response in vitro. We conclude that Rna01 positively affects the virulence of App and the strain WT_Δrna01 is a possible candidate for live attenuated vaccine, but further analysis is necessary.

Keywords: Porcine pleuropneumonia. Small regulatory RNAs. Cytokines. Live attenuated vaccine.