Estudo funcional do gene que codifica um transportador de membrana MFS em Colletotrichum lindemuthianum

Abstract

O fungo Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose do feijoeiro comum. Este fungo, assim como outros fungos fitopatógenos estão constantemente expostos a uma grande variedade de compostos tóxicos provenientes de várias fontes, o que torna imprescindível para estes o desenvolvimento de mecanismos de proteção contra estes produtos. Uma dessas estratégias está relacionada com a presença de proteínas transportadoras de membrana, como as pertencentes à Principal Superfamília Facilitadora (MFS), que podem fornecer aos fungos proteção contra compostos tóxicos evitando ou minimizando a ação destes, sendo em sua maioria essenciais para a manutenção da viabilidade celular. Este trabalho teve como objetivo inativar o gene mfs1 que codifica para um transportador de membrana da família MFS e investigar as alterações fenotípicas ocasionadas em um mutante C. lindemuthianum isolado LV49 (raça 89) para este gene. Para a obtenção do mutante foi necessário confirmar que o gene mfs1 encontrava-se presente em cópia única no genoma de C. lindemuthianum. O gene mfs1 pode estar organizado em um conjunto de genes com funções relacionadas, uma vez que downstream à região 3’ deste foi identificada uma segunda janela aberta de leitura correspondente a uma proteína da superfamília de fatores de transcrição contendo o domínio Zn2-Cys6, identificado como clft1. A análise do promotor do gene mfs1 revelou um putativo cis elemento de reconhecimento por proteínas desta família, o que sugere que esta proteína possa estar relacionada à regulação da expressão de mfs1. A técnica de Split- Marker mostrou-se eficiente na inativação do gene mfs1 de C. lindemuthianum, possibilitando o estudo da função do gene mfs1, em um mutante com integração específica e livre de integrações ectópicas. O mutante Δmfs1 não mostrou diferenças no perfil de sensibilidade a drogas comumente empregadas no controle da antracnose e em relação à patogenicidade, o mutante induziu mais precocemente os sintomas em folhas de feijoeiro susceptível, evidenciando uma situação de estresse decorrente da ausência do produto gênico. Foi observado também que o gene mfs1 exerce um papel primordial na manutenção da viabilidade celular de C. lindemuthianum, fato este confirmado pela conidiação alterada e pela confirmação de que este gene codifica para um transportador de membrana específico no transporte de hexoses, especificamente glicose, manose e frutose, uma vez que o mutante Δmfs1 mostrou crescimento reduzido quando cultivado em meios contendo apenas glicose, manose e frutose como fontes de carbono. A análise filogenética da proteína Mfs1 associada aos outros resultados obtidos nos sugere que este transportador é um membro da família SP, e que as proteínas MFS estão fortemente relacionadas com o tipo de substância que é transportada. Estudos de natureza básica sobre transportadores MFS são importantes para ampliar os conhecimentos sobre estas proteínas e a viabilidade celular em C. lindemuthianum.

Colletotrichum lindemuthianum is the causal agent of common bean antracnose. This fungus, like other phytopatogens, is constantly exposed to several toxic compounds from many sources, what makes indispensable the development of protection strategies against these products. One of these strategies is related to membrane transporters proteins like the Major Facilitator Superfamily (MFS), that could provide protection against toxic compounds or minimizing its action, being essential for the fungal cellular viability maintenance. In this context, this work aimed to inactivate the mfs1 gene encoding a MFS membrane transporter and investigate the phenotypic alterations entailed in an isolate C. lindemuthianum mutant LV49 (race 89) for this gene. To obtain the mutant, it was necessary to confirm if mfs1 gene was organized as a single copy in the C. lindemuthianum genome. The mfs1 gene can be organized in a cluster in view that a second open reading frame, which corresponds to a transcription factor superfamily containing a Zn2-Cys6 domain, identified as clft1, was observed in 3` downstream region of this gene. The mfs1 promoter analysis revealed a putative mfs1 element that is recognized by proteins of this family, what suggests that this protein could be related to the mfs1 expression regulation. The Split-Marker technique proved to be efficient in C. lindemuthianum mfs1 gene inactivation enabling the study of mfs1 function in a mutant by specific integrations without ectopic integrations. The Δmfs1 mutant showed no differences in drug sensibility profile when commonly drugs employed in antracnose control was used and in relation to pathogenicity, the mutant symptoms started earlier on susceptible bean leaves, showing a stress situation due to the genic product absence. It was also observed that mfs1 presents a primordial role in C. lindemuthianum cellular viability maintenance, what was confirmed by the altered conidiation observed, confirming that this gene encodes for a specific hexose membrane transporter, specifically carbon sources like glucose, mannose and fructose. The protein Mfs1 phylogenetic analysis allow us to conclude that this transporter is a SP family member and the MFS proteins are strongly related with the transported substance. Studies conducted with MFS transporters are important to broaden the knowledge of these proteins and to understand the cell viability in C. lindemuthianum.