Interferência de ácidos orgânicos na multiplicação de Salmonella spp. e expressão de genes relacionados a tolerância ácida

Abstract

Em condições de estresse ácido, micro-organismos do gênero Salmonella spp. utilizam como estratégia de sobrevivência um complexo mecanismo de tolerância que envolve vários genes. Os genes rpoS e nlpD são responsáveis pela expressão de proteínas que promovem a proteção da célula bacteriana contra os danos provocados pelo estresse, e os genes clpP, clpX e mviA estão envolvidos na regulação dessas proteínas no interior da célula. O presente estudo tem como objetivo associar as variações na expressão desses genes com as populações de Salmonella spp. durante um estresse ácido, condição que pode ser encontrada em carcaças bovinas que sofrem a aspersão de ácidos orgânicos para descontaminação microbiológica. A partir de uma coleção composta por 79 cepas de Salmonella spp., foi realizado um agrupamento genético por restrição enzimática através da técnica PFGE utilizando-se a enzima XbaI, e detecção dos genes rpoS, nlpD, clpP, clpX e mviA. Três cepas foram selecionadas (sorotipos: S. Derby, S. Typhimurium e S. Meleagridis) e semeadas em caldo extrato de carne com diferentes valores de pH (4,0, 5,0, e 6,0), ajustados com ácido lático e ácido acético. Logo após inoculação, e após 6, 12, 24 e 48 h de incubação a 37 °C, as populações bacterianas foram monitoradas por plaqueamento direto, e a expressão dos genes rpoS, nlpD, clpP, clpX e mviA por qPCR. Os resultados revelaram que Salmonella spp. pode se adaptar aos ácidos testados (acético e lático), principalmente quando estão em pH 5,0 ou 6,0, com expressão evidente do gene rpoS. Em pH 4,0, a redução completa das populações de Salmonella spp. ocorreu após 6 ou 24 h de incubação, o que em uma situação industrial representaria um período suficiente para que as proteínas da carne promovam o aumento do pH do meio, possibilitando dessa forma a adaptação de Salmonella spp. nesse substrato. A capacidade de adaptação de Salmonella spp. em valores de pH 5,0 e 6,0, demonstrada no presente estudo, ressalta a importância de um monitoramento adequado da redução de pH promovido pela aspersão de ácidos orgânicos em carcaças bovinas durante o processamento: caso o controle de pH não seja adequado, cepas de Salmonella spp. potencialmente contaminantes podem sobreviver e se manterem ativas nos produtos cárneos finais. Adicionalmente, é necessário que ocorra um equilíbrio entre a aplicação de ácidos orgânicos em concentrações que garantam o controle de Salmonella spp., além de outros micro-organismos, e a ausência de efeitos negativos sobre qualidade sensorial dos produtos cárneos, além de descoloração e exsudação. Os resultados obtidos permitem concluir que os ácidos orgânicos avaliados no presente estudo (ácido lático e ácido acético) podem ser considerados alternativas no controle de Salmonella spp., desde que ocorra um rígido controle dos valores de pH das soluções durante a interação com esse patógeno, e demanda o desenvolvimento de estudos em sistemas cárneos para demonstração desse comportamento.

Under acid stress conditions, Salmonella spp. presents a complex mechanism of tolerance that involves multiple genes. The rpoS, nlpD genes are responsible for the proteins expression that protect the bacterial cell against damage caused by acid stress, and clpP, clpX, mviA genes are involved in the regulation of these proteins inside the cell. The aim of this study was to associate the variations in these genes expression and Salmonella spp. populations when subjected to acid stress condition, a situation usually observed in bovine carcasses after cleaning procedures with organic acids spraying in slaughterhouse environment. Considering a culture collection composed by 79 Salmonella spp. strains, their fingerprinting were obtained by PFGE using XbaI, and all strains were subjected to PCR reactions to detect rpoS, nlpD, clpP, clpX, mviA genes. Based on the obtained data, three strains were selected (serotypes: S. Derby, S. Typhimurium and S. meleagridis) and inoculated in meat extract broth with different pH values (4.0, 5.0, and 6.0), adjusted with lactic acid and acetic acid. Immediately after inoculation, and after 6, 12, 24 and 48 h of incubation at 37 °C, the bacterial populations were monitored by direct plating, and the expression of rpoS, nlpD, clpP, clpX and mviA genes by qPCR . The results showed that Salmonella spp. can adapt to the tested acids (acetic and lactic), especially at pH 5.0 and 6.0, with evident expression of the rpoS gene. When the pH was adjusted to 4.0, complete reduction of Salmonella spp. populations occurred after 6 or 24 h of incubation, but in industrial situation this period would be sufficient for the meat proteins promote an increase in pH value, enabling the adaptation of Salmonella spp. on the substrate. The adaptability of Salmonella spp. at pH 5.0 and 6.0, as demonstrated in this study, shows the importance of adequate monitoring of pH reduction promoted by the organic acids spraying in bovine carcasses during processing: if pH control is not adequate, strains of Salmonella spp. can survive and remain active in the end meat products. Additionally, the ideal concentration of organic acids for the application in meat products depends in the balance between the pathogen contamination reduction and the absence of negative effects under sensorial quality. The results indicate that organic acids evaluated in the present study (lactic acid and acetic acid) can be considered as alternatives to control Salmonella spp., since associated to a rigorous pH control of the applied solutions during interaction with this pathogen. Furthermore, it demands further studies in meat systems to demonstrate this behavior.