Obtenção de linhagens de Kluyveromyces lactis recombinantes produtoras do imunógeno SBm 7462 contra o carrapato Riphicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887)

Abstract

O peptídeo denominado SBm 7462 (Sintético Boophilus microplus 7462) é uma vacina desenvolvida a partir da seqüência da proteína intestinal do carrapato B. microplus denominada Bm 86 apresentando ação imunogênica contra o mesmo. O carrapato B. microplus é um importante artrópode da medicina veterinária devido a perdas econômicas e problemas de saúde causados pelo referido parasita no gado da América Central e do Sul, bem como da Austrália. Este trabalho descreve a obtenção de linhagens de Kluyveromyces lactis recombinantes produtoras do referido peptídeo. Dois vetores de expressão integrativos foram construídos a partir do vetor pKLAC1: pKLAC1-seq1, contendo a seqüência 1 constituída por três cópias da seqüência de nucleotídeos que codifica para o SBm 7462 e o pKLAC1-seq4, contendo a seqüência 4 constituída por uma única cópia da seqüência de nucleotídeos que codifica o SBm 7462. As construções foram confirmadas por sequenciamento. O cassete de integração obtido pela clivagem do vetor com a enzima SacII foi utilizado na transformação da linhagem selvagem de K. lactis CBS2359. A integração dos cassetes por recombinação homóloga no locus LAC4 foi confirmada por PCR. A análise dos recombinantes de K. lactis por RT-PCR e a detecção do peptídeo, utilizando anticorpos monoclonais contra SBm 7462, comprovaram a transcrição e a expressão extracelular dos peptídeos. Os recombinantes foram cultivados em regime de batelada em YPGlicerol, alcançando uma concentração de biomassa de 10 g·L-1. A biomassa obtida foi transferida para o meio YNB com 4% (p/v) de lactose para induzir o promotor LAC4 e a síntese de SBm 7462 recombinante. Amostras foram analisadas quanto à concentração de proteína extracelular, por eletroforese em SDS-PAGE e detecção do imunógeno. A indução da síntese dos peptídeos foi testada sob duas condições: sem pulso adicional de lactose e com pulso de lactose, a cada 24 horas, durante 144 horas de indução. A concentração de proteínas extracelulares na segunda condição foi maior quando comparada com a condição sem pulso adicional de lactose. Atividade proteolítica não foi detectada no sobrenadante. O perfil eletroforético em SDS-PAGE revelando três bandas de aproximadamente 6, 10 e 21 kDa relacionadas ao peptídeo de interesse é discutido. A detecção do peptídeo vacinal com anticorpos monoclonais comprovou a presença extracelular do rSBm 7462.

The peptide designated SBm 7462 (Synthetic Boophilus microplus 7462) induces an immunogenic response against the tick B. microplus, an important arthropods in veterinary medicine due to the economic losses and the health problems caused in cattle production in Central and South America and Australia. Here we describe the construction of recombinant Kluyveromyces lactis yeast strains expressing the gene for rSBm 7462. Two integrative expression cassettes harboring one or three copies of the nucleotide sequence coding for the SBm 7462 were built from the vector pKLAC1. The construction of the expression vectors was confirmed by sequencing. The transformation of wild type K. lactis CBS2359, was performed and the integration of the cassettes by homologous recombination into the LAC4 locus of the transformed K. lactis genomes was verified by PCR. The transcription and extracellular expression of the peptides have been confirmed in recombinants K. lactis strains by RT-PCR and monoclonal antibodies against SBm 7462. The recombinants were cultured in shake-flask YPGlycerol medium generating 10 g·L-1 biomass. The biomass obtained was transferred to mineral medium with lactose 4% (w/v) to induce the LAC4 promoter and the synthesis of recombinant SBm 7462. Samples were analyzed for total protein, SDS-PAGE and immunogenic detection. The peptide production was investigated under two conditions: with additional lactose pulse at 24 hours intervals during 144 hours of induction and with no additional lactose pulse. The extracellular protein concentration in the first condition was higher compared to the condition with no additional pulse of lactose. Proteolytic activity was not detected into the medium. Three major protein bands of approximated 6, 10 and 21 kDa related to the desired peptide were detected by SDS-PAGE.