Functional analysis of mitochondrial proteins in Arabidopsis thaliana

Abstract

Mitochondrial carrier family (MCF) proteins catalyze the specific transport of various substrates, such as nucleotides, amino acids and cofactors. Although some of the mitochondrial transporters have been identified, many of these proteins have not yet been completely characterized. Likewise, the proteic machinery and mechanisms involved in the mitochondrial alternative respiration is still not well known. In this context, this work first presents a study of a previously identified but uncharacterized mitochondrial transporter AtSFC1, a potential succinate/fumarate carrier. Hence, to obtain the biochemical role of AtSFC1, we carried out substrate specificity and investigated its physiological function using 35S antisense transgenic lines in Arabidopsis thaliana. Briefly, the functional integration of AtSFC1 in the cytoplasmic membrane of intact Escherichia coli cells reveals a high specificity for a citrate/isocitrate in a counter exchange mode. Additionally, we discussed the potential role for AtSFC1 in the provision of intermediates of tricarboxylic acid cycle to provide carbon and energy to support growth in heterotrophic tissues. In the second part of this thesis, we investigated the function of alternative electron donors to the mitochondrial electron transport chain (mETC) during carbon deprivation as well as after the supply of amino acids. The breakdown products of branched chain amino acids can provide electrons to the mETC via the ETF/ETFQO (electron transfer flavoprotein: flavoprotein ubiquinone oxidoreductase) complex. This system is located in the mitochondria and induced at the level of transcription during stress situations. Thus, in order to obtain a comprehensive picture of how alternative respiration pathway interacts with other pathways and adjust to different cellular and metabolic requirements, we performed metabolic and physiological approaches using Arabidopsis cell culture ETFQO T-DNA insertion mutants. The results discussed here support that the ETF/ETFQO system is an essential pathway able to donate electrons to the ubiquinone pool. In addition, the behavior of the respiratory complexes suggest new electrons entry points, which must be elucidated.

A família de transportadores mitocondriais (MCF) catalisam transportes específicos de vários substratos, tais como nucleotídeos, aminoácidos e cofatores. Embora alguns dos transportadores tenham sido identificados, muitas destas proteínas ainda não foram completamente caracterizadas. Do mesmo modo, o metabolismo mitocondrial sob estresse ainda não é completamente conhecido. Neste contexto, este trabalho apresenta inicialmente um estudo de um transportador mitocondrial previamente identificado e ainda não caracterizado, designado como AtSFC1, um potencial transportador de succinato/fumarato. Assim, para identificar a especificidade de substrato, a proteína AtSFC1 foi integrada em liposomas e ensaios bioquímicos foram realizados e para investigar a função fisiológica deste transportador, foram utilizadas plantas transgênicas de Arabidospis thaliana para o gene AtSFC1, cuja expressão foi reduzida pela técnica antisenso. Brevemente, a integração funcional do AtSFC1 na membrana citoplasmática de células de Escherichia coli revelou uma especificidade para citrato/isocitrato do tipo antiporte. Além disso, discutimos o potencial papel para AtSFC1 no fornecimento de intermediários para o ciclo ácido dos tricarboxílicos para suportar o crescimento nos tecidos heterotróficos. Na segunda parte desta tese, investigou-se a função de doadores de elétrons alternativos para a cadeia mitocondrial transportadora de elétrons (mCTE) sob deficiência de carbono, bem como após o fornecimento de aminoácidos. Os produtos de degradação de aminoácidos de cadeia ramificada podem doar elétrons para o mCTE através do complexo ETF/ETFQO (electron transfer flavoprotein: flavoprotein ubiquinone oxidoreductase). Este sistema está localizado na mitocôndria e induzido ao nível de transcrição em situações de estresse. Assim, a fim de obter um design detalhado de como essa via interage com outras e como ela se ajusta a diferentes requisitos celulares e metabólicas, foram realizadas abordagens metabólicas e fisiológicas utilizando cultura de células de Arabidopsis mutantes com inserção de T-DNA na região codificante do gene ETFQO. Os resultados são aqui discutidos, confirmam que o sistema ETF/ETFQO é uma via essencial capaz de doar elétrons para o pool de ubiquinona. Além disso, o comportamento dos complexos respiratórios sugere novos pontos de entrada de elétrons, os quais devem ser elucidados.