Identificação, caracterização fenotípica e potencial aplicação tecnológica de bactérias láticas predominantes no leite humano em diferentes fases da lactação

Abstract

O leite humano (LH) tem a função de fornecer nutrientes e outras substâncias responsáveis pela defesa do organismo contra ameaças externas nos primeiros meses de vida. A sua microbiota tem sido estudada e durante um tempo acreditou-se que os micro-organismos a presença de micro-organismos nessa matriz fosse consequência da contaminação devido a manipulação inadequada. Posteriormente, admitiu-se que os micro-organismos fazem parte da composição natural do leite e que desempenham várias funções no organismo. Por diversos motivos, alguns recém- nascidos não podem consumir o leite produzido pelas próprias mães e a alternativa é o leite depositado em bancos de leite. Para eliminar micro-organismos patogênicos, o leite recebido nos bancos é pasteurizado, com isso também são eliminadas bactérias benéficas. O presente estudo teve como objetivo identificar, caracterizar fenotipicamente e selecionar bactérias com potencial para uso em bancos de leite humano. Foram coletadas amostras de leite de 11 voluntárias em cinco períodos da lactação (5, 15, 30, 60 e 90 dias após o parto) e a partir delas, isoladas colônias crescidas em meios de cultura específicos. Para agrupar os micro-organismos, extraiu-se o DNA total de cada amostra e realizou-se REP-PCR. Um representante de cada grupo foi identificado. Para os testes fenotípicos, as estirpes anteriormente identificadas foram avaliadas quanto a aspectos de segurança, como capacidade de produção da hemolisina, atividade da enzima gelatinase, suceptibilidade a antibióticos e verificação da forma isomérica do ácido lático produzido. A funcionalidade foi verificada por meio de teste de resistência ao suco gástrico e a sais biliares e antagonismo a patógenos indicadores. As culturas foram liofilizadas e novamente avaliadas. Após a formação de 74 grupos, foram identificadas duas espécies: Enterococcus faecalis (presentes em todas as fases da lactação) e Lactobacillus fermentum (presente no leite maduro de duas mães). Todas as estirpes resistiram ao processo de liofilização e foram classificadas como não β-hemolíticas, gelatinase negativas, resistentes ao suco gástrico e a sais biliares e com capacidade de antagonizar patógenos. Nenhum isolado foi sensível a todos antibióticos testados, porém, a sensibilidade de alguns aumentou após a secagem. Todos produziram ácido lático nas duas forma isoméricas. O isolado identificado com E. faecalis com a numeração 106 produziu L(+)-ácido lático em maior proporção independentemente de ser liofilizado ou não. Com os resultados obtidos não é possível indicar nenhuma das estirpes estudadas para uso imediato. O entendimento do real papel dessas bactérias no leite humano é necessário para que esses isolados possam ser considerados probióticos e possam ser reincorporados ao leite de BLH.

Human milk (HM) has the function of providing nutrients and other substances responsible for defending the body against external threats in the first months of life. Their microbiota has been studied and for a while it was believed that the microorganisms the presence of microorganisms in this matrix was a consequence of contamination due to improper handling. Subsequently, it was recognized that micro- organisms form part of the natural composition of milk and perform functions in the body. For various reasons, some newborns can not consume the milk produced by the mothers themselves and the alternative is milk deposited in milk banks (HMB). To eliminate pathogenic microorganisms, the milk received at the banks is pasteurized, thereby also eliminating beneficial bacteria. The present study aimed to identify, characterize phenotypically and select bacteria with potential for use in HMB. Milk samples were collected from 11 volunteers in five lactation periods (5, 15, 30, 60 and 90 days postpartum) and from them isolated colonies grown in specific culture media. To group the microorganisms, the total DNA was extracted from each sample and REP-PCR was performed. One representative from each group was identified. For the phenotypic tests, the previously identified strains were evaluated for safety aspects such as hemolysin production capacity, activity of the enzyme gelatinase, susceptibility to antibiotics and verification of the isomeric form of lactic acid produced. The functionality was verified through resistance test to gastric juice and to bile salts and antagonism to indicator pathogens. The cultures were lyophilized and retested. After the formation of 74 groups, two species were identified: Enterococcus faecalis (present in all stages of lactation) and Lactobacillus fermentum (present in mature milk of two mothers). All strains resisted the lyophilization process and were classified as non-β- hemolytic, gelatinase negative, resistant to gastric juice and bile salts and capable of antagonizing pathogens. No isolates were sensitive to all antibiotics tested, however, the sensitivity of some increased after drying. All produced lactic acid in the two isomeric forms. The isolate identified with E. faecalis with the number 106 produced L(+)- lactic acid to a greater extent regardless of whether it is lyophilized or not. With the results obtained, it is not possible to indicate any of the strains studied for immediate use. Understanding the true role of these bacteria in human milk is necessary so that these isolates can be considered as probiotics and can be reincorporated into BLH milk.