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Tipo: Tese
Título: Transcriptional profiling during pig skeletal muscle development of a Brazilian local breed and two commercial genetic groups
Título(s) alternativo(s): Perfil transcricional durante o desenvolvimento muscular esquelético de suínos de uma raça local Brasileira e dois grupos genéticos comerciais
Autor(es): Sollero, Bruna Pena
Primeiro Orientador: Guimarães, Simone Eliza Facioni
Primeiro coorientador: Silva, Fabyano Fonseca e
Segundo coorientador: Lopes, Paulo Sávio
Primeiro avaliador: Passos, Flávia Maria Lopes
Segundo avaliador: Ernst, Catherine W.
Resumo: Skeletal muscle development is a complex process involving the coordinated expression of thousands of genes. The aim of this study was to identify differentially expressed genes in longissimus dorsi (LD) muscle of pigs and their expression pattern through five time-points of the development. Firstly, a microarray analysis using the Pigoligoarray containing 20,400 oligonucleotides was done to compare two genetic groups of pigs that differ in muscularity (North American Yorkshire x Landrace (YL) crossbred pigs and Piau pigs -a naturalized Brazilian breed) at 40 and 70 days (d) of gestation (developmental stages encompassing primary and secondary fiber formation). A total of 486 oligonucleotides were differentially expressed (FC &#8805; 1.5; FDR &#8804; 0.05) between 40 and 70 d gestation in either YL or Piau pigs, and a total of 1,300 oligonucleotides were differentially expressed (FC &#8805; 1.5; FDR &#8804; 0.05) between YL and Piau pigs at either age. Gene ontology annotation and pathway analyses determined functional classifications for differentially expressed genes and revealed breed-specific developmental expression patterns. Thirteen genes were selected for confirmation by qRT-PCR analyses and expression patterns for most of these genes were confirmed, providing further insight into the roles of these genes in pig muscle development. The relative abundance of transcripts tended to be greater for the Piau pigs at 70 d of gestation suggesting that gene expression in LD muscle of YL pigs may be more delayed than in Piau pigs. The second experiment focused to evaluate the expression profile during prenatal (21, 40, 70 and 90 days pos conception) and early postnatal (10 weeks) stages of the same muscle between the local Brazilian pig breed (Piau) and a Brazilian white composite line. Based on qRT-PCR analyses, others fourteen genes related to intrinsic biological processes during myogenesis were investigated, and nine genes out of them were differentially expressed between both genetic groups (P<0.05). Significant different levels of expression were also observed through the five time points and patterns of genes related to cell proliferation, cell differentiation, energy metabolism, and maintenance were distinct in a breed-specific way. A new reference gene for expression profile investigation of pig muscle not used before for this purpose is proposed: DDIT3 (DNA-damage-inducible transcript 3). Furthermore, this research evaluated the application of three different protocols for data normalization and assessment of genes differentially expressed in microarray analyses. A trade-off among the results was observed when comparing the three protocol analyses tested by distinct statistical methods. The two new protocols proposed, in comparison with the first microarray analysis applied in the first chapter, detected genes as DE only in two (C40vsP40 and P40vsP70) out of the four contrasts under evaluation (C40vsP40, P40vsP70, C70vsP70 and C40vsC70). The results strengthened the idea that the Robust Spline normalization method was able to identify more genes differentially expressed (FDR-False Discovery Rate &#8804;0.05) related with important GO terms involved with the muscle development process (especially in breed-contrasts) in comparison with the Loess method. In addition, normexp background correction method was advisable, working clearly better than the traditional subtraction method. It was suggested that the q-value FDR method can be too flexible to detect genes differentially expressed in small microarray experiments, while the BH FDR method can be too restrictive for that although pointing out genes DE with higher fold change values and with similar functionalities related to the myogenesis process in context. In general, this study which was the first whole-genome expression evaluation of the Brazilian native Piau pigs, revealed both developmental and breed-specific patterns of gene expression in fetal pig skeletal muscle including genes not previously associated with myogenesis, and these information can contribute to future pig genetic improvement efforts. Also, comparisons among protocol analyses for microarray data are suggested for cleaning and improving the quality of the measures of gene expression.
Abstract: O desenvolvimento esquelético muscular é um processo complexo que envolve a expressão coordenada de milhares de genes. O objetivo deste estudo foi identificar genes diferencialmente expressos no músculo longissimus dorsi (LD) de suínos, bem como seus padrões de expressão entre cinco estádios do desenvolvimento. Primeiramente, uma análise de microarranjo utilizando o Pigoligoarray, contendo 20.400 oligonucleotídeos, foi realizada para comparar dois grupos genéticos de suínos que diferem em capacidade de crescimento muscular e conteúdo de carne magra (grupo cruzado comercial Yorkshire-Landrace-YL, proveniente dos Estados Unidos e suínos Piau- raça Brasileira naturalizada) aos 40 e 70 dias (d) de gestação (estádios do desenvolvimento decorrentes da formação de fibras musculares primárias e secundárias). Um total de 486 oligonucleotídeos foram diferencialmente expressos (FC &#8805; 1.5; FDR &#8804; 0.05) entre 40 e 70 dias de gestação no grupo YL ou Piau, e um total de 1.300 oligonucleotíedos foram diferencialmente expressos (FC &#8805; 1.5; FDR &#8804; 0.05) entre suínos YL e Piau em ambas as idades pré-natais. Anotações baseadas no Gene Ontology (GO) e análises de vias metabólicas determinaram classificações funcionais para os genes diferencialmente expressos e revelaram padrões de expressão raça-específicos. Treze genes foram selecionados para confirmação por análises de qRT-PCR e os padrões de expressão para a maioria destes genes foram confirmados, gerando informações relevantes sobre seus papéis desempenhados durante o processo do desenvolvimento muscular de suínos. Na raça Piau a abundância relativa de transcritos aos 70 d de gestação foi tendencialmente maior, sugerindo que a expressão gênica no músculo LD de suínos YL pode ser atrasada em relação à raça local. O segundo experimento objetivou avaliar perfis de expressão durante cinco períodos pré-natais (21, 40, 70 e 90 dias pós-concepção) e um período pós-natal (10 semanas pós-nascimento) no mesmo músculo esquelético (LD) entre a raça Brasileira local Piau e uma linhagem comercial também brasileira. Baseado em análises de qRT-PCR, outros quatorze genes relacionados a processos biológicos intrínsecos ao processo de miogênese foram investigados, e nove destes genes foram significativamente (P<0.05) diferencialmente expressos entre ambos os grupos genéticos de suínos. Níveis significativos de expressão gênica também foram observados entre os cinco estádios avaliados e padrões de genes relacionados à proliferação celular, diferenciação celular, metabolismo de energia e manutenção da formação muscular foram distintos de forma raça- específica. Um novo gene referência, não utilizado como tal previamente em estudos de expressão muscular de suínos, foi proposto: DDIT3 (DNA-damage-inducible transcript 3). A última etapa desta pesquisa objetivou avaliar a aplicação de três protocolos para normalização e detecção de genes diferencialmente expressos em análises de microarranjos. Resultados conflitantes foram observados quando comparado os três protocolos analisados por distintos métodos estatísticos. Os dois protocolos propostos, em relação à primeira análise de microarranjo aplicada no primeiro capítulo, detectaram genes como diferencialmente expressos em apenas dois (C40vsP40 e P40vsP70) dos quarto contrastes sob avaliação (C40vsP40, P40vsP70, C70vsP70 e C40vsC70). Os resultados demonstraram que o método de normalização Robust Spline foi capaz de identificar um maior número de genes diferencialmente expressos (FDR-Taxa de Falsas Descobertas &#8804;0.05) relacionados a importantes GO terms envolvidos no processo de desenvolvimento muscular (especialmente em contrastes entre idades) em comparação ao método Loess. Além do mais, o método de correção background normexp foi recomendado, uma vez que se mostrou mais acurado do que o método tradicional de Subtração. Foi sugerido que o método FDR q-value pode ser muito flexível na detecção de genes diferencialmente expressos em pequenos experimentos de microarranjo, enquanto o método BH pode ser muito restritivo ainda que capaz de apontar genes DE com maiores valores de expressão relativa e funcionalmente relacionados ao processo de miogênese em contexto. Em geral, este estudo, que pela primeira vez avaliou em nível genômico a expressão de genes da raça Piau, revelou padrões de expressão gênica raça e idade-específicos durante o desenvolvimento muscular fetal, incluindo genes não descritos previamente como associados a tal processo. Tais informações podem contribuir para futuros avanços do melhoramento genético de suínos. Também, comparações entre diferentes protocolos de análises de microarranjos foram sugeridas, a fim de melhorar a qualidade e representar de forma mais clara as medidas de expressão gênica.
Palavras-chave: Microarray
Myogenesis
Skeletal muscle
Microarranjo
Miogênese
Músculo esquelético
CNPq: CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::ZOOTECNIA::GENETICA E MELHORAMENTO DOS ANIMAIS DOMESTICOS
Idioma: eng
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Genética e Melhoramento de Animais Domésticos; Nutrição e Alimentação Animal; Pastagens e Forragicul
Programa: Doutorado em Zootecnia
Citação: SOLLERO, Bruna Pena. Perfil transcricional durante o desenvolvimento muscular esquelético de suínos de uma raça local Brasileira e dois grupos genéticos comerciais. 2010. 145 f. Tese (Doutorado em Genética e Melhoramento de Animais Domésticos; Nutrição e Alimentação Animal; Pastagens e Forragicul) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2010.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/1759
Data do documento: 19-Out-2010
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