Expressão gênica da rota biossintética da lignina e imuno-histoquímica da parede celular em Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen (Amaranthaceae) cultivada in vitro sob atmosfera enriquecida de CO2

Abstract

Dentre as espécies de interesse fitoterápicos destaca-se Pfaffia glomerata, conhecida popularmente como fáfia ou ginseng brasileiro. A propagação in vitro é uma importante alternativa no cultivo de plantas com propriedades farmacológicas e nutricionais de interesse industrial. No cultivo in vitro, a concentração de CO 2 no interior dos frascos contendo meio de cultura é reduzida, o que limita a fotossíntese. No sistema fotoautotrófico in vitro, as plantas são propagadas em meios de cultura onde a fonte de carbono é, exclusivamente, do CO 2 das trocas gasosas. Ao submeter a planta a um maior regime de concentração de CO 2 , há o aumento das trocas gasosas, aumentando a qualidade da planta e sua sobrevivência, pois gera plantas mais vigorosas e com maior acúmulo de biomassa. A parede celular vegetal constitui grande porção da biomassa vegetal, sendo uma complexa mistura de macromoléculas, podendo ser celulose, pectinas, xiloglucanos, heteroxilanos, heteromananos, lignina, entre outros. Desta forma, o presente estudo tem como objetivo analisar a dinâmica estrutural da deposição de parede celular assim como a expressão de genes envolvidos na biossíntese de lignina em plantas de Pfaffia glomerata durante o cultivo in vitro em atmosfera enriquecida com CO 2 . Para isso, vitroplantas de P. glomerata foram propagadas vegetativamente em meio MS sem adição de sacarose. As plantas foram colocadas em câmaras de acrílico com ar forçado contínuo a 400 e 1000 μL L -1 de CO 2 , e frascos controle foram posicionados do lado de fora das câmaras, sem ventilação forçada. O experimento foi avaliado aos 20, 30 e 40 dias de cultivo, totalizando nove tratamentos com 4 repetições. Foram realizadas análises de crescimento, fotossíntese e imunohistoquímica (utilizando anticorpos monoclonais JIM7, JIM13, LM5, LM10 e LM11) e, aos 40 dias, avaliação da expressão dos genes relacionados à rota biossintética da lignina (PgC4H, PgCCoAOMT, PgCCR, PgCAD e PgCOMT). O enriquecimento de CO 2 na concentração de 1000 μL L -1 induziu maior crescimento e o maior acúmulo de massa vegetal, além de aumentar a taxa fotossintética. Os tratamentos com ventilação forçada, levaram a diminuição da expressão dos genes PgC4H, PgCAD e PgCCR em relação ao controle, sendo que o tratamento com ventilação forçada de 400 μL L -1 teve os menores níveis de expressão. Os genes PgCCoAOMT e PgCOMT não apresentaram expressão significativa em relação ao controle. As análises de imunohistoquímica mostraram que a deposição das pectinas detectadas pelo anticorpo JIM7 diminuiu ao longo do experimento. Quanto às pectinas detectadas pelo anticorpo LM5, apenas o tratamento de 1000 µL L -1 de CO 2 apresentou marcação intensa na região do xilema. A deposição de hemiceluloses e glicoproteínas, utilizando respectivamente os anticorpos LM10 e LM11 e o anticorpo JIM13, foi detectada exclusivamente nas regiões de parede secundária, diferindo apenas na intensidade, sendo o tratamento de 1000 µL L - de CO 2 o mais expressivo. O desenvolvimento in vitro de P. glomerata, em meio fotoautotrófico com atmosfera enriquecida com CO 2 , foi efetivo no aumento das taxas fotossintéticas, crescimento e acúmulo de biomassa. Além disso, o cultivo foi responsável por promover a diminuição da expressão dos genes da via de síntese da lignina e promover o incremento dos polissacarídeos da parede celular.

Pfaffia glomerata, popularly known as Brazilian ginseng, stands out as an important species of phytotherapic interest. In vitro propagation is an important alternative to the cultivation of plants with pharmacological and nutritional properties of industrial interest. In in vitro culture, the CO 2 concentration inside the flasks containing culture medium is reduced, which limits the photosynthesis. In the photoautotrophic in vitro system, plants are propagated in culture media where the CO 2 from gas exchanges is the exclusive source of carbon. By subjecting the plant to a higher CO 2 concentration regime, there is an increase in gas exchange, thus increasing the quality of the plant and its survival, as it generates more vigorous plants and with greater accumulation of biomass. The plant cell wall constitutes a large portion of the plant biomass, being a complex mixture of macromolecules, which can be cellulose, pectins, xyloglucans, heteroxylans, heteromannans and lignin, among others. Thus, the present study aims to analyze the structural dynamics of cell wall deposition as well as the expression of genes involved in lignin biosynthesis in Pfaffia glomerata plants during in vitro culture in CO 2 enriched atmosphere. Vitroplants of P. glomerata were propagated vegetatively in MS medium without addition of sucrose. The plants were placed in acrylic chambers with continuous forced air at 400 and 1000 μL L -1 CO 2 , and control vials were positioned outside the chambers without forced ventilation. The experiment was evaluated at 20, 30 and 40 days of cultivation, totaling nine treatments with 4 replicates. Analyzes of growth, photosynthesis and immunohistochemistry (using monoclonal antibodies JIM7, JIM13, LM5, LM10 and LM11) were performed and, at 40 days, an evaluation of genes related to lignin biosynthetic route (PgC4H, PgCCoAOMT, PgCCR, PgCAD and PgCOMT) was performed. The enrichment of CO 2 at the concentration of 1000 μL L -1 induced higher growth and greater accumulation of vegetal mass, besides an increase in the photosynthetic rate. The treatments with forced ventilation led to a decrease in the expression of PgC4H, PgCAD and PgCCR genes in relation to the control, and the forced ventilation treatment of 400 μL L -1 had the lowest levels of expression. The PgCCoAOMT and PgCOMT genes did not show significant expression in relation to the control. Immunohistochemical analyzes showed that the deposition of pectin detected by the JIM7 antibody decreased throughout the experiment. The pectins detected by the LM5 antibody showed intense marking in the xylem region only in the treatment of 1000 μL L -1 of CO 2 . The deposition of hemicelluloses and glycoproteins, using respectively the LM10, LM11 and the JIM13 antibody, was detected exclusively in the secondary wall regions, differing only in intensity, with the treatment of 1000 μL L -1 of CO 2 being the most expressive. In vitro development of P. glomerata, in photoautotrophic medium with CO 2 enriched atmosphere, was effective in the increase of the photosynthetic rates, growth and accumulation of biomass. In addition, the cultivation was responsible to promoting the reduction of the expression of genes of the lignin synthesis pathway and promoting the increase in polysaccharides of the cell wall.