New insight into the antibacterial activity of emulsifying salts used in processed cheese: from in vitro to in situ application

Abstract

Processed cheese (PC) is a dairy product with multiple end-use applications, where emulsifying salts play a fundamental role in physicochemical changes during production. Moreover, some of these salts may be a strategy to control spoilage and pathogenic microorganisms, contributing to safety and shelf-life extension. In the construction of this thesis, four steps were employed to assess the antimicrobial activity of different emulsifying salts. (i) In the first step, the inhibitory activity of a commercial polyphosphate (JOHA ® HBS, at different concentrations, from 0.2% to 3.0%) was tested in vitro against 21 bacterial strains by streak assay, agar-spot method, spot-on-the-lawn and well-diffusion method. Different culture medium (Brain Heart Infusion Broth, Nutrient, Plate Count, Trypticase Soy), either in liquid or solid form, were used. In all the protocols performed, the solid culture medium (Nutrient agar) was more effective for the inhibition of the target bacteria; results of the streak assay showed that 11 out the 21 tested strains were highly inhibited at 0.5% of JOHA ® HBS. (ii) In this step, we selected Bacillus thuringiensis CFBP 3476 and Clostridium perfringens ATCC 13124 to access the in situ inhibitory activity of two emulsifying salts (ESSP = short polyP and BSLP = long polyP). PC samples were produced through laboratory-scale and pilot-scale, inoculated and analyzed until 45 days of storage at 6 ± 2 ºC. C. perfringens ATCC 13124 growth was not affected (p > 0.05), but both of the treatments reduced B. thuringiensis CFBP 4376 counts in the tested conditions (p < 0.05); a higher and faster reduction in samples produced by the laboratory-scale method was obtained. (iii) In the third step, a total of 14 treatments (T1-T14) composed by mixtures of emulsifying salts (ESSP, BSLP and trisodium citrate) and antimicrobial additives (nisin and potassium sorbate) were evaluated against eight target strains. PC samples were produced through laboratory- scale, inoculated and analyzed until 90 days of storage at 6 ± 2 ºC. Most treatments resulted in some level of bactericidal or bacteriostatic effect against the target microorganisms. Bactericidal activity was evident against Bacillus spp., and bacteriostatic effect was clear against C. perfringens ATCC 13124, Enterococcus faecalisFAIR-E 179, Listeria monocytogenes Scott A and Staphylococcus aureus ATCC 6538 (p < 0.05) during the storage period. The treatments in which BSLP was applied alone showed greater inhibitory activity; that is, equal concentrations of BSLP result in less bacterial inhibition when in the presence of ESSP. (iv) In the last step, the bacteriostatic effect of six emulsifying salts, containing different concentrations of phosphorus pentoxide (P 2 O 5 ), was investigated in PC samples deliberately contaminated with B. cereus spores. Also, the influence of PC processing methods (pasteurization and creaming), storage temperature (6 and 30 ºC) and storage time (until 120 days) were evaluated. Results showed that lower storage temperature and emulsifying salts significantly influenced bacterial growth. In addition, the creaming process and the P 2 O 5 content enhanced the inhibitory effect of emulsifying salts; PC treated with the highest concentration of P 2 O 5 , the lowest average value of both vegetative cells and spore was detected. Finally, the four steps of this study reveals that: (i) Nutrient medium and agar- based tests are required to properly test the inhibitory activity of polyphosphates; (ii) the inhibitory effect of emulsifying salts against B. thuringiensis in PC obtained by two different methods was confirmed; (iii) the composition of emulsifying salts significantly influences bacterial inhibition and the phosphate interactions may infer such activity and; (iv) the creaming process and the P 2 O 5 content can improve the inhibitory effect of emulsifying salts on B. cereus vegetative and spore growth in PC. Taken together, the results contribute to expanding the understanding of emulsifying salt application in PC, with a focus on microbiological safety and shelf-life. However, more detailed studies are needed to determine the specific emulsifying salt composition and the relation of P 2 O 5 content responsible for bacterial inhibition. Keywords: Dairy products. Emulsifiers. Microbiological stability. Pathogenic bacteria. Polyphosphates. Shelf-life.

O queijo processado (QP) é um produto lácteo com múltiplas aplicações finais, onde os sais emulsificantes desempenham um papel fundamental nas alterações físico-químicas durante a produção. Além disso, alguns desses sais podem ser uma estratégia para controlar a deterioração e microrganismos patogênicos, contribuindo para a segurança e extensão da vida de prateleira. Na construção desta tese, quatro etapas foram empregadas para avaliar a atividade antimicrobiana de diferentes sais emulsificantes. (i) Na primeira etapa, a atividade inibitória de um polifosfato comercial (JOHA ® HBS, em diferentes concentrações, de 0,2% a 3,0%) foi testado in vitro contra 21 cepas bacterianas através dos métodos de estrias, agar-spot, spot-on-the-law e well-diffusion. Foram utilizados diferentes meios de cultura (Infusão de Cérebro e Coração, Nutriente, Plate Count, Tripticase de Soja), ambos na forma líquida e sólida. Em todos os protocolos realizados, o meio de cultura sólido (ágar Nutriente) foi mais eficaz para a inibição das bactérias alvo; os resultados do ensaio de estrias mostraram que 11 das 21 cepas testadas foram altamente inibidas a 0,5% de JOHA ® HBS. (ii) Nesta etapa, selecionamos Bacillus thuringiensis CFBP 3476 e Clostridium perfringens ATCC 13124 para acessar a atividade inibitória in situ de dois sais emulsificantes (ESSP = polyP curto e BSLP = polyP longo). Amostras de QP foram produzidas em escala laboratorial e piloto, inoculadas e analisadas até 45 dias de armazenamento a 6 ± 2 ºC. O crescimento de C. perfringens ATCC 13124 não foi afetado (p > 0,05), mas ambos os tratamentos reduziram as contagens de B. thuringiensis CFBP 4376 nas condições testadas (p < 0,05); obteve-se uma redução maior e mais rápida nas amostras produzidas pelo método em escala laboratorial. (iii) Na terceira etapa, um total de 14 tratamentos (T1-T14) compostos por misturas de sais emulsificantes (ESSP, BSLP e citrato trissódico) e aditivos antimicrobianos (nisina e sorbato de potássio) foram avaliados contra oito cepas alvo. Amostras de QP foram produzidas em escala laboratorial, inoculadas e analisadas até 90 dias de armazenamento a 6 ± 2 ºC. A maioria dos tratamentos resultou em algum nível de efeito bactericida ou bacteriostático contra os microrganismos alvo. A atividadebactericida foi evidente contra Bacillus spp., e o efeito bacteriostático foi claro contra C. perfringens ATCC 13124, Enterococcus faecalis FAIR-E 179, Listeria monocytogenes Scott A e Staphylococcus aureus ATCC 6538 (p < 0,05) durante o período de estocagem. Os tratamentos em que o BSLP foi aplicado isoladamente apresentaram maior atividade inibitória; isto é, concentrações iguais de BSLP resultam em menos inibição bacteriana quando na presença de ESSP. (iv) Na última etapa, o efeito bacteriostático de seis sais emulsificantes, contendo diferentes concentrações de pentóxido de fósforo (P 2 O 5 ), foi investigado em amostras de QP deliberadamente contaminadas com esporos de B. cereus. Também foi avaliada a influência dos métodos de processamento do QP (pasteurização e creme), temperatura de armazenamento (6 e 30 ºC) e tempo de armazenamento (até 120 dias). Os resultados mostraram que temperaturas de armazenamento mais baixas e os sais emulsificantes influenciaram significativamente o crescimento bacteriano. Além disso, o processo de cremificação e o teor de P 2 O 5 potencializaram o efeito inibitório dos sais emulsificantes; QP tratado com a maior concentração de P 2 O 5 apresentou o menor valor médio tanto de células vegetativas quanto de esporos. Por fim, as quatro etapas deste estudo revelam que: (i) o meio de cultura Nutriente e os testes baseados em ágar são necessários para avaliar adequadamente a atividade inibitória de polifosfatos; (ii) foi confirmado o efeito inibitório de sais emulsificantes contra B. thuringiensis em PC obtido por dois métodos diferentes; (iii) a composição dos sais emulsificantes influencia significativamente a inibição bacteriana e as interações do fosfato podem inferir tal atividade e; (iv) o processo de cremificação e o teor de P 2 O 5 podem melhorar o efeito inibitório de sais emulsificantes sobre o crescimento vegetativo e de esporos de B. cereus em QP. Considerando tudo, os resultados contribuem para ampliar o entendimento da aplicação de sais emulsificantes em QP, com foco na segurança microbiológica e vida de prateleira. No entanto, estudos mais detalhados são necessários para determinar a composição específica do sal emulsificante e a relação do teor de P 2 O 5 responsável pela inibição bacteriana. Palavras-chave: Produtos lácteos. Emulsificantes. Estabilidade microbiológica. Bactérias patogênicas. Polifosfatos. Vida de prateleira.