Modelling of the Staphylococcus aureus growth and enterotoxin a production based on different conditions

Abstract

Staphylococcus aureus is one of the pathogens most involved in food outbreaks. Enterotoxigenic S. aureus produce enterotoxins stable at high temperatures. This is a concern for dairy products, like Minas frescal cheese, since enterotoxins can be produced in early stages of production (raw milk) and remain stable after thermic treatments, like pasteurization. Therefore, it is necessary to adopt appropriate measures to prevent contamination and the eventual toxins production. Predictive microbiology is a powerful tool for food safety and quality. Using mathematical models, it is possible to predict the behavior of microorganisms under specific conditions. Given that Minas frescal cheese is strongly associated with S. aureus, mathematical models are relevant to demonstrate how bacterial growth and enterotoxins production are influenced by production and storage conditions. Thus, this study aimed to characterize the physicochemical aspects and the presence of S. aureus in Minas frescal cheese and, based on this data, create predictive models of growth and the production of enterotoxin A by S. aureus. Samples of Minas frescal cheese (n = 50) were obtained and subjected to pH, sodium chloride concentration, and temperature analysis. The presence and characterization of Staphylococcus spp. were evaluated, and coagulase-positive isolates were investigated for the presence of the nuc gene for S. aureus identification and enterotoxin genes (sea, seb, sec, sed, see). Based on this data, growth models (Combase and response surface model) and enterotoxin production models (probabilistic logistic regression model) were developed and statistically and experimentally validated. All coagulase-positive isolates tested were confirmed as S. aureus, and none presented genes related to enterotoxins. The pH, temperature, and salt concentration varied from 5.80 to 6.62, from 5 °C to 12 °C, and from 0.85% to 1.70%, respectively. The model generated by Combase assessed the influence of temperature, pH, and salt concentration on the growth kinetics (maximum growth rate and lag time) of S. aureus and found values ranging from 0.012 to 0.419 log CFU/mL/h of growth rate and adaptation time from 4.60 to 159.24 hours. Temperature was the factor that most influenced the growth kinetics, and salt concentration did not significantly influence the responses. Subsequently, response surface models and logistic regression models were developed to assess the growth responses of S. aureus and the probability of enterotoxin A (SEA) production, respectively. In addition to the factors assessed in the growth kinetics, different levels of initial contamination of S. aureus and time were incorporated into the models. With the exception of sodium chloride concentration, all factors significantly affected the growth and production of enterotoxin A by S. aureus. The maximum population obtained ranged from 8.27 to 9.36 log CFU/mL at 25 °C and from 3.90 to 8.27 log CFU/mL at 15 °C. At 10 °C, at the lowest contamination level evaluated, S. aureus (100 CFU/mL) remained below the detection limit (<1.0 CFU/mL) throughout incubation, and no SEA production occurred, while for the other concentrations (103 CFU/mL and 105 CFU/mL), the maximum population was 7.79 CFU/mL, highlighting the importance of maintaining Minas frescal cheese at refrigeration temperatures and controlling the initial contamination level. SEA production occurred for all conditions evaluated at 15 °C and 25 °C, but at different times. The models showed a good fit to the experimental data, with satisfactory values for R² (0.90), accuracy factor (1.09), and bias factor (0.99) for the growth model; a high agreement percentage (94.4%), Nagelkerke's R² (0.92), and the Hosmer and Lemeshow test (p > 0.05) for the SEA production model. Additionally, experimental validation in culture media, milk, and cheese confirmed that the models are suitable for predicting the growth and the probability of SEA production by S. aureus in Minas frescal cheese. Keywords: Staphylococcus aureus. Enterotoxin A. Minas frescal cheese. Predictive microbiology. Mathematical models.

Staphylococcus aureus é um dos patógenos de maior envolvimento em surtos alimentares. S. aureus enterotoxigênicos produzem enterotoxinas estáveis a altas temperaturas. Isto é preocupante para produtos lácteos, como o queijo Minas frescal, uma vez que enterotoxinas podem ser liberadas pelo microrganismo no leite cru e não serem destruídas por processos térmicos, como a pasteurização. Portanto, é necessário adotar medidas adequadas para prevenir a contaminação e a eventual produção de toxinas. A microbiologia preditiva é uma ferramenta poderosa para a segurança e qualidade dos alimentos. A partir dela, modelos matemáticos são capazes de prever o comportamento microbiano em condições específicas de desenvolvimento. Considerando a elevada frequência de S. aureus em queijo Minas frescal, modelos matemáticos são relevantes para demonstrar como a sua multiplicação e a produção de enterotoxinas são influenciados por condições de produção e armazenamento. Assim, este estudo teve como objetivo caracterizar os aspectos físico-químicas e a presença de S. aureus em queijo Minas frescal, e a partir desses dados, criar modelos preditivos de multiplicação e produção de enterotoxina A por este patógeno. Amostras de queijo Minas frescal (n = 50) foram obtidas e submetidas a análises de pH, concentração de cloreto de sódio e temperatura. A presença e caracterização de Staphylococcus spp. foram avaliadas e os isolados coagulase-positivo foram investigados quanto à presença de gene nuc para identificação da espécie e genes de enterotoxinas (sea, seb, sec, sed, see). A partir das informações obtidas, modelos de multiplicação (Combase e modelo superfície de resposta) e produção de enterotoxinas (modelo de probabilidade de regressão logística) foram desenvolvidos e validados estatisticamente e experimentalmente. Todos os isolados coagulase-positivo testados foram confirmados como S. aureus e nenhum apresentou genes relacionados à enterotoxina. O pH, a temperatura e a concentração de NaCl variaram de 5,80 a 6,62, de 5 °C a 12 °C e de 0,85% a 1,70%, respectivamente. O modelo gerado pelo Combase avaliou a influência da temperatura, pH e concentração de cloreto de sódio na cinética de multiplicação de S. aureus e encontrou valores variando de 0,012 a 0,419 log UFC/mL/h de taxa de multiplicação e tempo de adaptação de 4,60 a 159,24 h. A temperatura foi o fator que mais influenciou na cinética de multiplicação e o cloreto de sódio não influenciou significativamente nas respostas. Posteriormente, modelos de superfície de resposta e de regressão logística foram desenvolvidos para avaliar as respostas de multiplicação de S. aureus e a probabilidade de produção de enterotoxina A (SEA), respectivamente. Além dos fatores avaliados na cinética de multiplicação, diferentes níveis de contaminação inicial de S. aureus e o tempo foram incorporados aos modelos. Com exceção da concentração de cloreto de sódio, todos os fatores afetaram significativamente a multiplicação e a produção de SEA pelo microrganismo. A população máxima obtida variou de 8,27 log UFC/mL a 9,36 log UFC/mL a 25 °C e de 3,90 log UFC/mL a 8,27 log UFC/mL a 15 °C. A 10 °C, no menor nível de contaminação avaliado. S. aureus (100 UFC/mL) permaneceu abaixo do limite de detecção (<1,0 UFC/mL) durante toda a incubação e não houve produção de SEA, enquanto para as demais concentrações (103 UFC/mL e 105 UFC/mL), a máxima população foi de 7,79 UFC/mL, demonstrando a importância de manter o queijo Minas frescal a temperaturas de refrigeração e controlar o nível de contaminação inicial. SEA foi produzida em todas as condições avaliadas a 15 °C e 25 °C, mas em diferentes tempos. Os modelos apresentaram bom ajuste aos dados experimentais, com valores satisfatórios de R2 (0,90), fator de precisão (1,09) e fator bias (0,99) para o modelo de multiplicação e, alta porcentagem de concordância (94,4%), R2 de Nagelkerke (0,92) e teste de Hosmer e Lemeshow (p > 0,05) para o modelo de produção de SEA. Além disso, a validação experimental em meio de cultura, leite e queijo confirmou que modelos são apropriados para prever as respostas de multiplicação e a probabilidade de produção de SEA por S. aureus no queijo Minas frescal. Palavras-chave: Staphylococcus aureus. Enterotoxina A. Queijo Minas frescal. Microbiologia preditiva. Modelos matemáticos. Cinética de multiplicação.