Use este identificador para citar ou linkar para este item: https://locus.ufv.br//handle/123456789/9982
Tipo: Dissertação
Título: Caracterização bioquímica da proteína S-64, envolvida no transporte de sacarose em soja (Glycine max (L.) Merrill)
Biochemical Characterization of a Sucrose Binding Protein Homologue From Soybean (Glycine max L. (Merill))
Autor(es): Pirovani, Carlos Priminho
Abstract: O cDNA da proteína S-64, homóloga à proteína de ligação à sacarose (SBP), foi previamente isolado de uma biblioteca de expressão de cotilédones de soja. A seqüência de aminoácidos deduzida da proteína S-64 apresenta 85% de identidade com a proteína de ligação à sacarose (SBP), um provável sinal, um sítio consenso de glicosilação e um sítio consenso de ligação à ATP/GTP. Nessa investigação, uma versão truncada da proteína S-64 foi expressa em E. coli e a proteína recombinante purificada, utilizada em ensaios de caracterização bioquímica. Além da alta conservação de seqüência com SBP, o fracionamento subcelular de cotilédones demonstrou que a proteína S-64 está associada a membranas. Consistente com sua localização subcelular, o terminal amino hidrofóbico da proteína parece ter função de Peptídeo sinal, uma vez que a proteína intacta não foi acumulada em E. coli, ao passo que a proteína S-64 isenta do Peptídeo sinal foi eficientemente sintetizada em bactéria. Provavelmente, o sistema de secreção da E. coli reconheceu o terminal hidrofóbico da proteína intacta, e a proteína recombinante foi secretada e degradada. No entanto, tradução in vitro do RNA sintético de S-64 usando reticulócitos de coelho, na presença de membranas microssomais pancreáticas caninas, demonstrou que o Peptídeo sinal de S-64 não é clivado. Tal resultado indicou que a proteína S-64 é uma proteína de membrana do tipo II, e o seu terminal amino apresenta as funções de Peptídeo sinal, endereçando a proteína para o retículo endoplasmático; e domínio transmembrana, fixando a proteína na membrana plasmática. A capacidade de S-64 oligomerizar foi avaliada em géis semidesnaturantes e o seu domínio de oligomerização mapeado, correspondente aos aminoácidos 36 a 343, usando-se versões truncadas da proteína. A possibilidade de a proteína ligar-se à GTP por meio do seu sítio consenso de ligação a nucleotídeos foi determinada por “GTP dot blot”. A proteína S-64 liga-se à GTP, preferencialmente à ATP, uma vez que uma versão de S-64 produzida em E. coli foi marcada radioativamente por [ 32 Pα]-GTP, na presença de ATP não marcado como competidor. O sítio de ligação à GTP foi delimitado pelo teste de perda de função a partir de mutação dirigida in situ. De fato, mutação no putativo sítio de ligação a ATP/GTP bloqueia a referida atividade da proteína. Tais resultados estabelecem que a proteína S-64 é, de fato, uma proteína de ligação à GTP associada à membrana. A atividade de ligação à GTP da proteína pode estar envolvida na regulação da função da proteína como transportadora de sacarose.
A sucrose binding protein (SBP) homologue, named S-64 protein, was previously identified by cloning its cDNA from a soybean cotyledon expression library. The deduced aminoacid sequence for S-64 shares 85% identity with the sucrose-binding protein (SBP), possesses a putative peptide signal, a potential site for N-linked glycosylation and a nucleotide (ATP/GTP)-binding consensus sequence. In this investigation, the S-64 gene and truncated versions of the cDNA were expressed in E. coli and the purified recombinant proteins were used in biochemical characterization assays. In addition to high sequence conservation with SBP, subcellular fractionation of cotyledon cells demonstrated that the S-64 protein is a membrane-associated protein. Consistent with its subcellular localization, the hydrophobic amino terminus of the protein seems to function as a signal peptide because an intact protein failed to accumulate in E. coli, whereas a peptide signal free-protein was efficiently produced in E. coli. Probably the secretion system of E. coli recognized the hydrophobic stretch of aminoacids and the heterologous protein was secreted and degraded. Nevertheless, in vitro translation of synthetic S-64 RNA using a cell-free system in the presence of microsomal membranes demonstrated that the S-64 signal peptide was not cleaved. These results suggest that the S-64 is a type II membrane protein and its peptide signal may serve as dual function. It may address the synthesis of the protein to the endoplasmic reticulum (ER) and may target the protein to membranes. The ability of the protein to undergo oligomerization was analyzed in native gels. The S-64 oligomerization domain was mapped to an internal region of the protein, aminoacids 36 a 343, by assaying the ability of truncated versions of the proteins to oligomerize in native gels. The ability of the protein to associate with nucleotides thought its conserved binding sequence was determined by a GTP-binding blot assay. The S-64 protein binds GTP, rather than ATP, because the E. coli produced S-64 was radiolabeled by [ 32 Pα]- GTP in the presence of large excess of unlabeled ATP competitor. The GTP binding site was delimited by loss of function assays in which the ability of site directed mutants to retain the GTP binding activity was evaluated. In fact, mutation in the putative GTP/ATP binding site blocked GTP binding. These results established that the S-64 protein is, in fact, a GTP-binding membrane-associated protein. The GTP binding activity of S-64 may be involved in the regulation of the protein function.
Palavras-chave: Proteína
Sacarose
CNPq: Ciências Biológicas
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Citação: PIROVANI, Carlos Priminho. Caracterização bioquímica da proteína S-64, envolvida no transporte de sacarose em soja (Glycine max (L.) Merrill). 1999. 62 f. Dissertação (Mestrado em Fisiologia Vegetal) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. 1999.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/9982
Data do documento: 4-Mar-1999
Aparece nas coleções:Fisiologia Vegetal

Arquivos associados a este item:
Arquivo Descrição TamanhoFormato 
texto completo.pdftexto completo280,75 kBAdobe PDFThumbnail
Visualizar/Abrir


Os itens no repositório estão protegidos por copyright, com todos os direitos reservados, salvo quando é indicado o contrário.